염증소체(inflammasome)는 일반적으로 센서 단백질, 어댑터 단백질, 전염증성 카스파제(caspase) 등으로 구성되어 있으며 염증반응을 활성화하는 세포질 다중단백질 올리고머이다[1]. 염증소체는 감염이나 세포 스트레스와 관련된 다양한 자극을 인식하면 카스파제-1을 활성화해 다양한 기능을 하는 것으로 알려져 있다[2-4]. 현재까지 NLR family pyrin domain-containing 1 protein (NLRP1), NLRP3, NLRP6, NLRC4 등 다양한 염증소체가 밝혀져 있으나 이 중 NLRP3의 기능이 가장 많이 알려져 있다. NLRP3는 염증소체의 한 종류로서 세포 항상성을 포함한 숙주의 면역반응에 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다. NLRR3는 병원체 관련 분자패턴(pathogen-associated molecular pattern) 또는 손상 관련 분자패턴(damage-associated molecular pattern)을 인식할 수 있으며 박테리아, 바이러스, 곰팡이, 내인성 스트레스 신호와 같은 다양한 자극에 의해 만들어진다[5,6].

최근 연구에서 NLRP3가 만성통증 발생에 중요한 작용을 한다는 것이 보고되었다. 피하조직으로 complete Freund’s adjuvant (CFA)를 주사하여 염증성 통증을 유발한 실험 동물의 척수에서 신경통증 발현을 증명하는 표지인자인 janus kinase 2 (Jak2)나 signal transducer and activator of transcription 3 (Stat3)의 인산화를 관찰하였으며, 이러한 인산화 과정에 NLRP3가 관여한다고 보고하였다[7]. 최근 연구에서 NLRP3가 신경병성통증 발생에도 중요하게 작용한다는 것을 보고하였는데, 실험 동물의 좌골신경을 묶어서 만성 손상을 유발하면 신경병성통증이 발생하였으며 요추 4–6번 척수 신경에서 NLRP3의 발현이 유의하게 증가하였다[8]. 이러한 실험 결과는 다양한 통증 반응에 척수 수준에서 NLRP3가 발현하여 통증 발생에 관여한다는 것을 보여주고 있다. 최근 얼굴 영역에서 발생하는 통증에도 NLRP3가 관련된다는 것을 보고하였다. 치수를 노출해 치수염을 유발한 실험 동물에서 치아 통증이 발생하였으며, 삼차신경 척수핵에서 NLRP3, purineric receptor P2X7 (P2X7), interleukin-1β (IL-1β)가 증가한 것을 관찰하였다[9]. 또한 통증이 발생한 동물에 P2X7 억제제를 복강으로 투여하면 삼차신경 척수핵에서 NLRP3 발현을 억제하면서 치아 통증이 감소하였다[9]고 보고하였다. 이러한 실험 결과는 중추성 NLRP3가 얼굴 영역에서 발생하는 통증에도 중요하게 작용할 수 있다는 것을 보여주고 있다. 그러나 현재까지 안면 영역에서 발생하는 염증성 통증에 말초조직에 있는 NLRP3의 발현이 통증 발생에 어떠한 영향을 미치는지에 대한 연구는 매우 부족한 현실이다.

본 연구에서 얼굴 영역에서 발생하는 염증성 통증 발생에 말초조직에서 발현한 NLRP3가 어떠한 역할을 하는지 알아보기 위하여 연구를 수행하였다. 얼굴 영역에서 발생하는 염증성 통증모델로는 안면 피하 영역으로 포르말린을 주사하여 나타나는 통증 행위 반응이나, CFA를 주사하여 발생하는 열 통증 반응을 측정하였다. NLRP3 길항제를 피하조직으로 투여하여 염증성 통증에 미치는 영향을 평가하였으며, NLRP3 작용제를 피하조직으로 투여하여 통증 반응을 직접 야기하는지 평가하였다. 또한 NLRP3가 발생하는 통증 반응에 IL-1β나 hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) 등의 물질이 관여하는지를 평가하였다.

Chemicals

포르말린은 JUNSEI (Tokyo, Japan)에서, CFA는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서, NLRP3 억제제인 MCC950과 HIF-1α 억제제인 PX-478은 Selleckchem (Houston, TX, USA)에서, NLRP3 작용제인 BMS-986299는 MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, USA)에서, 그리고 IL-1 수용기 차단제(IL-1 receptor antagonist, IL-ra)는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구매하였다. 포르말린, CFA, MCC950, PX-478, 그리고 IL-1ra는 생리식염수에 녹여서 사용하였으며 BMS-986299는 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여서 희석한 최종농도가 1.6%가 되게 사용하였다.

Animals

실험동물은 몸무게가 230–280 g 정도 되는 수컷의 Sprague–Dawley계 흰 쥐를 사용하였고, 경북대학교 치과대학에 있는 실험동물실에서 12시간 간격으로 빛 순환주기를 갖추고 있는 환경에서 사료와 물을 공급하여 사육하였다. 본 연구는 경북대학교 동물실험윤리위원회의 승인(KNU2023-0048)을 얻었으며, 세계 통증 연구학회에서 승인한 전신 마취하지 않고 의식이 깨어 있는 동물을 실험하는 윤리적 규정을 준수하였다.

Animal pain models

안면 포르말린 테스트(orofacial formalin test): 안면에 염증성 통증을 발생시키기 위하여 포르말린을 안면 피하로 주입하였다. 포르말린을 주입하여 나타나는 통증 행위 반응을 평가하는 방법은 선행연구에서 사용된 방법에 준하여 평가하였다[10-13]. 실험 동물을 조용하고 투명한 플라스틱 상자에서 두어 최소 15분 이상 실험동물을 환경에 적응시킨 다음 행동 반응을 평가하였다. 안면 피하조직으로 포르말린 5% 용액을 30 μL의 양으로 주사한 다음 투명한 관찰 상자로 이동시키고 포르말린 주사에 의해 나타나는 통증 행위를 기록하였고, 얼굴 부위를 다리로 긁는 행위를 통증의 지표로 삼았다. 포르말린을 주입한 다음 5분 간격으로 60분 동안 통증 반응을 기록하였으며, 짧게 지속하는 초기의 일차반응(0–10분, first phase)과 이어서 나타나는 지속적인 이차반응(11–60분, second phase)으로 나누어 평가하였다.

CFA에 의해 유도되는 염증성 열 통증 모델(CFA-induced thermal hyperalgesia): 안면 영역에 만성 열 통증을 유발하기 위해 3% isoflurane을 이용하여 마취한 실험 동물에서 CFA oil과 생리식염수를 혼합한 용액(1:1 비율)을 40 μL 용량으로 안면 피하조직에 주사하여 염증을 유발시켰다. CFA를 안면 영역 피하조직으로 주입하여 열 통증을 평가한 실험은 선행연구와 같이 진행하였으며 CFA 주입 후 첫째 날부터 열과민성 통증이 발생하였고 약물 주입 후 14일째가 되면 주입하기 전과 같은 양상으로 회복된다는 것을 이미 보고한 바 있다[14]. 본 연구에서 사용한 방법을 간단하게 설명하면 열 통증에 대한 실험동물의 회피 반응을 평가하기 위하여 목만 빼내어 얼굴을 자유롭게 움직일 수 있도록 제작된 관찰용 투명한 플라스틱 통에 실험동물을 한 마리씩 각각 넣어 열 자극에 의한 통증 행위 반응을 평가하였다. 실험 동물을 최소 30분 이상 실험 환경에 적응시킨 다음 계속 실험을 실시하였다. 열 자극을 위해 레이저 자극기(Infrared Diode Laser, LVI-808-10; LVI tech, Seoul, Korea)를 이용하였으며 얼굴 피부로부터 10 cm가 되는 거리에서 90° 각도로 열 자극을 가하였다[13,15,16]. 열 자극의 세기는 11 W와 18.1 A로 하였으며, 얼굴 영역에 열 자극을 적용한 다음 실험동물이 피하는데 걸리는 시간(head withdrawal latency)을 이용하여 평가하였다. 열 자극은 조직손상을 최소화하기 위해 시간 간격을 5분으로 하여 2번 이상의 열 자극을 적용한 평균값으로 평가하였으며, cut-off time을 20초로 설정하였다.

Experimental protocols

말초조직에서 NLRP3 억제제가 포르말린에 의해 발생하는 통증 반응에 미치는 영향: 포르말린으로 유도되는 통증 행위에 NLRP3가 관여하는지 확인하기 위하여 포르말린 투여 2시간 전에 실험동물의 안면 피하조직으로 NLRP3 억제제인 MCC950을 투여하였다. 피하조직으로 MCC950을 50, 100 μg/50 μL 용량으로 주사하여 2시간이 경과한 다음 피하조직으로 30 μL의 포르말린(5%) 용액을 주사하여 나타나는 통증 행위 반응을 평가하였다. 포르말린 투여 후 약물을 주입한 부위를 긁는 행위(scratching) 반응을 보여주었으며 통증 반응의 빈도를 5분 간격으로 60분까지 기록하였다. 대조군으로는 생리식염수를 주입한 다음 포르말린을 주사하였다.

말초조직에서 NLRP3 억제제가 CFA 유도 열 통증에 미치는 영향: CFA 주입 후 시간에 따른 열 통증을 평가하였다. CFA 주사 후 열 통증이 발생한 다음 최고로 유지되는 5일째 NLRP3 억제제인 MCC950 (50, 100 μg/50 μL)을 안면 피하조직으로 주사한 다음 열 통증을 평가하였다. 열 통증은 약물 투여 후 30, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 300, 360, 1,440분에 평가하였다. 대조군으로는 생리식염수를 주입한 다음 평가하였다.

NLRP3 작용제가 통증 발생에 미치는 영향: 염증성 통증 모델에서 NLRP3 억제제인 MCC950이 통증 발생을 억제한다는 실험 결과는 NLRP3가 통증 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 보여준다. 따라서 피하조직에 생성된 NLRP3가 직접 통증을 유발하는지 확인하기 위하여 NLRP3 작용제를 실험동물 피하로 직접 주사하여 통증 행동 반응을 측정하였다. NLRP3 작용제인 BMS-986299를 사용하였으며 50 또는 100 μg/50 μL 용량으로 피하 주사한 다음 1시간 동안 실험동물의 통증 반응을 관찰하였다. 또한 NLRP3가 어떠한 경로를 통하여 통증 반응을 일으키는지 확인하기 위하여 IL-1 수용기 차단제인 IL-1ra (50 ng/20 μL)를 투여하고 10분 후에, HIF-1-α 차단제인 PX-478 (50 μg/50 μL)을 투여하고 2시간 이후에 NLRP3 작용제인 BMS-986299를 100 μg/50 μL 용량으로 피하를 처치하여 나타나는 반응을 평가하였다. BMS-986299 대조군으로 1.6% DMSO 용액을 사용하였으며 IL-1ra와 PX-478의 대조군으로는 생리식염수를 사용하였다.

Statistical analysis

실험 결과의 유의성을 검증하기 위해 SPSS 25버전 프로그램(IBM Corp., Armonk, NY, USA)을 사용하였다. 시간에 따른 포르말린 통증 반응과 CFA 유도 열 통증 실험 결과는 다중 그룹에서 반복측정 분산분석법과 Holm−Sidak 사후 분석법을 이용하였다. 개별적인 시간에서 유의성과 다중그룹에서 유의성을 확인하기 위해서 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였으며 두 군과의 검증은 t-test를 이용하여 검증하였다. 통계적 유의성 비교 분석을 위하여 유의성 값은 p<0.05로 설정하였다. 모든 실험 결과는 평균±표준 오차(standard error of the mean)로 표시하였다.

얼굴 부위에 포르말린을 투여하여 나타나는 통증 행위 반응에 말초조직으로 투여한 NLRP3 차단제가 미치는 영향을 평가한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 실험동물 흰 쥐의 안면피부에 30 μL의 포르말린(5%) 용액을 주사하면 통증 행위 반응으로 안면 부위의 피부를 긁는 반응을 관찰하였다. 이러한 반응은 짧게 나타나는 초기 일차반응과 이어서 나타나는 지속적인 이차 반응으로 나타났다. 먼저 시간에 따른 통증 행위 반응의 변화를 관찰한 결과에서 포르말린 주입 2시간 전 NLRP3 차단제인 MCC950 (50, 100 μg/50μL)을 얼굴 부위의 피하조직으로 주입하면 대조군에서 생리식염수를 주입한 군과 비교하여 볼 때 포르말린으로 유도되는 통증 행위 반응을 유의하게 억제하였다(F[2, 18]=838.337, p<0.05, Fig. 1A). 포르말린으로 발생하는 통증 행위 반응을 1차와 2차 반응으로 구분하여 평가한 결과에서 MCC950 (50, 100 μg/50 μL)을 투여한 군에서 모두 통증 억제 반응을 보여주었다. 특히 MCC950을 100 μg의 용량으로 주입한 결과에서 대조군을 주입한 결과와 비교하여 볼 때 이차반응에서 통증 행위 반응이 461±35회에서 208±34회로 유의하게 억제되었다(p<0.05, Fig. 1B). 또한 이러한 통증 억제 반응은 MCC950 용량에 따라 농도 의존적으로 나타났다.

Fig. 1. Effects of MCC950, an NLR family pyrin domain-containing 3 protein inhibitor, on orofacial formalin-induced pain behavior. (A)Analysis of the time course of formalin-induced behavioral responses. Administration of 5% formalin (30 μL) induced nociceptive behavior, and subcutaneous pretreatment with MCC950 (100 μg/50 μL) significantly reduced nociceptive behavior. (B) Number of scratches during formalin-induced behavioral responses in the first and second phases. Subcutaneous pretreatment with MCC950 (50, 100 μg/50 μL) significantly attenuated nociceptive behavior in the second phase. There were 7 animals in each group. *p<0.05, MCC950- vs. vehicle-treated group.

실험동물 흰 쥐의 안면 피부에 CFA를 주입한 다음 열 자극을 가하면 통증 과민 현상을 관찰하였다. CFA를 주입한 실험동물은 대조군과 비교하여 볼 때 주입 1일 후부터 열 통증 과민 현상을 보여주었으며, 대조군과 비교하여 볼 때 CFA 주입 후 7일까지 유의하게 통증 과민 현상이 지속되었다(F[1, 12]=4.008, p<0.05, Fig. 2A). 말초 피하조직으로 투여한 NLRP3 차단제가 CFA를 주입한 실험동물에서 발생하는 열 통증 과민현상에 미치는 작용을 평가한 결과를 Fig. 2B에 나타내었다. CFA 주입 후 통증 반응이 가장 심하게 나타나는 5일째 되는 날 NLRP3 억제제인 MCC950 (50, 100 μg/50 μL)을 얼굴 부위의 피하조직으로 투여한 다음 열에 반응하는 통증 행위 반응을 관찰한 결과 열 통증에 대한 과민반응이 유의하게 억제되었다(F[2, 18]=5.563, p<0.05, Fig. 2B). MCC950을 100 μg의 용량으로 주입한 결과에서 대조군을 주입한 결과와 비교하여 볼 때 주입 후 120분이 지나서 머리를 회피하는 시간이 유의하게 증가하였으며, 이러한 열 통증에 대한 과민반응 억제현상은 약물 주입 후 6시간 동안 지속되었다. 그리고 약물 주입 후 24시간이 지나면 열 자극에 머리를 회피하는 시간은 약물 투여 전의 값으로 회복되었다.

Fig. 2. Effects of MCC950, an NLR family pyrin domain-containing 3 protein inhibitor, on complete Freund^ʼs adjuvant (CFA)-induced thermal hyperalgesia. (A) Subcutaneous injection of CFA produced thermal hyperalgesia 1 day after the injection, and this thermal hyperalgesia persisted for 7 days. (B) On the 5th day after CFA injection, subcutaneous treatment with MCC950 (50, 100 μg/50 μL) significantly reduced thermal hyperalgesia. There were 7 animals in each group. *p<0.05, MCC950- vs. vehicle-treated group.

말초조직으로 NLRP3 작용제인 BMS-986299를 투여한 다음 나타나는 통증 행위 반응을 Fig. 3에 나타내었다. 안면 피하조직으로 BMS-986299를 50 μg 또는 100 μg/50 μL 용량으로 투여한 다음 1시간 동안 긁는 통증 행위 반응을 관찰한 결과 대조군에 비해 통증 반응이 유의하게 증가하였으며 농도 의존적인 형태로 관찰되었다.

Fig. 3. Effects of NLR family pyrin domain-containing 3 protein (NLRP3) agonist on nociceptive scratching behavior in naïve rats. Subcutaneous injection of BMS-986299 (50, 100 μg/50 μL, MedChemExpress; Monmouth Junction, NJ, USA), an NLRP3 agonist, produced significant nociceptive behavior. There were 7 animals in each group. *p<0.05, BMS-986299- vs. vehicle-treated group.

BMS-986299 투여로 나타나는 통증 반응에 어떠한 경로가 참여하는지 확인하기 위하여 IL-1β 수용기 차단제를 NLRP3 작용제 투여 10분 전에 주사한 다음 통증 반응을 평가하였다(Fig. 4A). 피하조직으로 전처치한 IL-1β 수용기 차단제(IL-1ra, 50 ng/20 μL)는 BMS-986299를 100 μg/50 μL 용량으로 투여하여 발생하는 통증 행위 반응을 유의하게 억제하였다(p<0.05, Fig. 4A). 그러나 HIF-1α 차단제인 PX-478 (50 μg/50 μL)을 전처치한 다음 NLRP3 작용제를 투여하면 BMS-986299에 의해 발생하는 통증 행위 반응에 아무런 영향을 미치지 못하였다(Fig. 4B).

Fig. 4. Effects of interleukin 1 receptor antagonist (IL-1ra), and PX-478, an HIF-1α inhibitor, on BMS-986299-induced nociceptive scratching behavior. (A) Blocking the IL-1β pathway inhibited the nociceptive behavior induced by BMS-986299. (B) Blocking the HIF-1α pathway did not affect BMS-986299-induced nociceptive behavior. There were 7 animals in each group. *p<0.05, IL-1ra or PX-478- vs. vehicle-treated group.

본 연구는 말초조직에서 NLRP3의 경로를 차단하면 포르말린으로 유도되는 통증 행위 반응이나 CFA를 주입하여 발생하는 열 통증 과민현상이 유의하게 억제되는 것을 보여주고 있다. 또한 말초조직으로 NLRP3 경로를 활성화시키면 통증 행위 반응을 야기하였으며, 피하조직으로 전처치한 IL-1β 수용기 차단제는 NLRP3 작용제인 BMS-986299에 의해 발생하는 통증 행위 반응을 유의하게 억제하였다. 이러한 실험 결과는 말초조직에서 발생하는 염증성 통증에 NLRP3 경로가 매우 중요하게 작용한다는 것을 말해주며 NLRP3는 IL-1β를 통하여 통증 반응을 일으키는 것으로 판단된다. 이러한 결과는 향후 말초조직에서 NLRP3 경로 조절이 새로운 진통제 개발에 중요한 근간을 제공해 줄 수 있다는 것을 보여주고 있다.

본 연구에서 NLRP3 차단제인 MCC950을 안면 피하조직으로 주입하면 포르말린에 의해 유도되는 통증 행위 반응이 유의하게 억제되었다. 이러한 실험 결과는 포르말린에 의해 발생하는 통증 반응이 말초조직에서 NLRP3를 발현시켜 나타나는 것으로 보인다. 그러나 최근까지 포르말린에 의해 유도되는 염증성 통증에 말초성 NLRP3가 관여하는지에 대한 연구는 거의 없는 실정이다. 말초조직에서 발생하는 NLRP3가 염증성 통증에 관여한다는 것은 본 연구에서 CFA를 주사하여 발생하는 염증성 통증에 NLRP3 차단제인 MCC950을 피하조직으로 투여한 실험으로도 증명된다. 본 연구에서 안면 피하조직으로 CFA를 주사하면 만성적인 열 통증이 발생하였으며, 주사 5일 후 NLRP3 차단제인 MCC950을 피하조직으로 주사하면 열 통증 과민현상이 유의하게 억제되었다. 이러한 실험 결과는 말초조직에서 발현하는 NLRP3가 만성 염증성 통증 발생에 매우 중요하게 작용한다는 것을 말해 준다. NLRP3가 통증 발생에 관여한다는 것은 선행연구에서도 관찰할 수 있다. 실험동물 뒷다리에 CFA를 주사하여 염증성 통증을 유발시키면 척수와 뒷발 피부조직에서 NLRP3뿐만 아니라 caspase recruitment domain과 카스파제-1의 발현을 증가시켰다[7,17-19]. 이러한 실험 결과는 척수에서 발현한 NLRP3가 만성적인 염증성 통증 발생에 매우 중요하게 작용한다는 것을 말해준다. 또한 NLRP3는 신경병성통증 발생에도 관여한다고 보고되었는데, 좌골신경을 손상시키면 척수에서 NLRP3가 활성화되었으며 NLRP3를 억제하면 신경병성통증이 유의하게 감소되었다[20]. 이러한 실험 결과는 만성적인 통증 발생에 중추성 NLRP3가 매우 중요하게 작용한다는 것을 보여준다. 최근 연구에서 CFA를 발등 피부에 주사하여 염증반응을 유발하였을 때 피부조직에서 NLRP3의 발현이 증가된 것을 보고하였다[21]. 그러나 말초 조직에서 발현하는 NLRP3가 염증성 통증 발생에 관여한다는 직접적인 보고는 거의 없는 실정이다.

최근 보고된 연구에서 치수염을 유발시켜 치아 통증을 발생시키면 삼차신경 척수핵에서 NLRP3를 포함하여 IL-1β 등이 증가하였다[9]는 실험 결과는 얼굴 부위에서 발생하는 만성통증 발생에도 NLRP3가 관여한다는 것을 증명하고 있다. 나아가 zymosan이나 CFA를 악관절 내로 주입하면 만성적인 악관절통이 발생할 뿐만 아니라 삼차신경절 내에 NLRP3가 발현이 유의하게 증가하였다[22]는 보고와 치수염을 유발하여 치아 통증을 발생시켰을 때 삼차신경절에서 NLRP3가 증가하였다[9]는 실험 결과는 말초조직에서 생성되는 NLRP3가 얼굴 영역에 발생하는 만성통증에 관여한다는 것을 암시하고 있지만 아직까지 통증 행동 반응을 이용하여 이러한 작용을 규명한 실험은 거의 없는 실정이다. 본 연구에서 NLRP3 차단제인 MCC950을 안면 피하조직으로 주입하여 포르말린에 의해 유도되는 통증 행위 반응과 CFA를 주사하여 발생하는 열 통증 과민현상을 모두 유의하게 억제한 실험 결과는 말초성 NLRP3가 안면부위에서 발생하는 염증성 통증 발생에 매우 중요하게 작용한다는 것을 증명하고 있다.

본 연구에서는 말초조직에서 발현된 NLRP3가 직접 통증을 유발하는지 확인하기 위하여 NLRP3 작용제인 BMS-986299를 피하조직으로 주사한 다음 통증 행위 반응을 관찰하였다. 말초조직으로 주사한 NLRP3는 유의한 통증 행위 반응을 발생하였다. NLRP3 억제제를 투여하여 염증성 통증을 억제한 결과뿐만 아니라 NLRP3 작용제를 투여하여 통증이 발생한 실험 결과는 말초조직으로 발현된 NLRP3는 본 연구에서 수행한 염증성 통증 발생에 매우 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다. 또한 본 연구에서 염증성 물질인 NLRP3 작용제를 말초조직으로 투여하면 실험동물에서 통증 행위 반응인 긁는 행위를 보여주는데, 이러한 실험 결과는 염증 물질인 포르말린을 투여하면 나타나는 통증 행위 반응[10-13]과도 매우 유사하다. 비록 포르말린을 주사하여 나타나는 통증모델과 같이 1, 2차 통증 반응이 뚜렷하게 나타나지는 않지만 NLRP3 작용제를 투여하면 1시간 동안 통증 행위 반응이 발생하기 때문에 향후 염증성 통증을 평가하는 실험 모델로 사용할 수 있을 것으로 판단된다. 비록 본 연구에서는 말초조직에서 발현하는 NLRP3가 악안면 영역에서 발생하는 염증성 통증에 관여하는 것을 증명하였지만 향후 신경병성통증 등을 포함하는 만성통증 발생에도 말초성 NLRP3 경로가 관여하는지에 대한 연구가 추가적으로 필요해 보인다.

NLRP3 작용제인 BMS-986299를 피하조직으로 주사한 다음 나타나는 통증 행위 반응을 이용하여 어떠한 경로를 이용하여 통증을 야기하는지에 대한 연구를 진행하였다. 본 연구에서 피하조직으로 전처치한 IL-1β 수용기 차단제는 BMS-986299에 주사로 발생하는 통증 행위 반응을 유의하게 억제하였으나 HIF-1α 차단제인 PX-478은 BMS-986299에 의해 발생하는 통증 행위 반응에 아무런 영향을 미치지 못하였다. 이러한 실험 결과는 말초조직에 발현한 NLRP3는 IL-1β를 통하여 통증을 발생시킨다는 것을 보여주고 있다. NLRP3의 발현과 IL-1β와의 관계는 선행연구에서 보고되었다. 일반적으로 NLRP3는 카스파제-1 효소 활성화에 의해 IL-1β와 IL-18로 분해되는 것으로 알려져 있다[6]. 많은 선행 연구에서 척수신경이나 말초신경이 손상되어 신경병성통증이 발생할 때 척수에서 IL-1β 발현이 증가되는 것을 보고하였는데[23-25], 이때 NLRP3가 관여할 것으로 보여 진다. 이러한 실험 결과는 본 연구 결과와 함께 NLRP3는 IL-1β를 통하여 염증성 통증을 야기하는 것을 암시한다. 또한 세포성장, 상처 치유, 혈관재생 등에 관여하는 HIF-1α [26]는 최근 시토카인 발현에 중요하게 작용한다고 보고되었으나[27], 본 연구에서는 말초조직에 발현한 NLRP3가 작용할 때 HIF-1α 경로는 관여하지 않는 것을 보여주었다. 최근 연구에서 NLRP3의 다양한 작용기전을 보고하였는데, 뒷다리에 CFA를 주사하여 염증성 통증을 유발한 실험동물의 척수에서 신경통증 마커인 Jak2나 Stat3를 인산화하여 NLRP3를 활성화시킨다는 보고[7]는 NLRP3가 IL-1β뿐만 아니라 다양한 경로를 통하여 통증 발생에 관여하고 있다는 것으로 보여준다. 또한 좌골 신경을 만성적으로 결찰하여 신경병성통증을 유발시키면 NLRP3 유전자가 미세아교세포나 별아교세포에서 증가한다[28]고 보고하였다. 이러한 실험 결과는 중추신경계의 신경교세포에서 NLRP3가 발현하여 통증발생에 중요하게 작용한다는 것을 의미한다. 따라서 이러한 경로를 정확하게 밝히기 위해서는 향후 추가 연구가 필요해 보인다.

이상의 실험 결과를 요약해 보면 본 연구에서 말초조직에서 NLRP3의 경로를 차단하면 포르말린이나 CFA를 주입하여 발생하는 통증을 유의하게 억제하였으며 NLRP3 경로를 활성화시키면 통증 행위 반응을 발생시켰다. 피하조직으로 전처치한 IL-1 수용기 차단제는 NLRP3 경로를 활성화시켜 발생하는 통증 행위 반응을 유의하게 억제하였다. 이러한 실험 결과는 말초조직에서 NLRP3와 IL-1β 경로가 만성 염증성 통증 발생에 중요하게 작용한다는 것을 말해주며 만성통증을 조절하는 중요한 핵심분자(key molecule)라는 것을 보여주고 있다. 따라서 향후 말초조직에서 NLRP3 경로 조절이 새로운 진통제 개발에 중요한 근간을 제공해 줄 수 있다.

This research was supported by the National Research Foundation of Korea (NRF) grant funded by the Korean government (2022R1A2C2092262).

The authors declare that they have no competing interests.