두경부 편평세포암종(head and neck squamous carcinoma cells, HNSCC)은 구강, 인두 및 후두의 점막 상피에서 발생하며 두경부의 가장 흔한 악성 종양이다[1,2]. HNSCC의 발병은 일반적으로 담배 및 알코올 남용과 관련이 있으며 인간 유두종 바이러스(human papillomavirus) 감염에 의해서 그 발병이 증가하였다[2,3]. 두경부암의 치료 방법은 구강암의 경우 화학요법과 방사선의 복합요법으로 이루어지며 인두암과 후두암의 경우 일차적으로 방사선치료가 시행된다[1,2,4]. 그러나 이러한 요법의 장기 사용은 골수기능 저하, 신장기능 저하, 위장장애 등 다양한 부작용을 초래하여 사용에 제한을 두고 있으므로, 부작용이 적고 항암활성이 뛰어난 소재에 대한 연구가 필요하다[5].

세포사멸(apoptosis)은 유전적으로 프로그램화되어 조절되는 세포사멸의 한 형태를 말하며 1972년 Kerr 등[6]에 의해 논문에서 처음 사용되었으며, 아직까지도 그들의 개념과 현상이 인용되고 있다[7,8]. 세포사멸은 조직 내 일정 수의 세포를 유지하는 등 항상성을 유지하기 위한 방어 기전이다[6,9]. 세포사멸의 비정상적인 기능은 세포 성장과 세포 사멸 사이의 불균형으로 인해 여러 질병을 야기한다. 세포사멸이 불충분하면 과도한 세포증식으로 인해 암 등의 질병이 발생하고, 세포사멸이 과도하면 정상적인 세포들도 사멸하여 알츠하이머병과 같은 퇴행성 질환이 유발된다[9,10]. 따라서, 세포의 성장 주기를 멈추거나 세포사멸 활성을 유도하는 것이 암 치료제의 효과적인 전략이 될 수 있으며, 기존의 대부분의 항암제는 세포 사멸을 유도하는 기전을 가지고 있다[9-11]. Caspase는 세포사멸을 조절하는 중요한 효소로서 caspase-2, -8, -9, -10은 initiator caspase이고 caspase-3, -6, -7은 세포사멸을 수행하는 effector caspase이다[12,13]. 또한 미토콘드리아 외막의 세포사멸 조절에 관여하는 Bcl-2 계열 단백질은 caspase-8에 의해 활성화되고, 활성화된 tBID는 항-세포사멸인자인 Bcl-2를 억제하며 세포사멸 촉진인자인 Bax 및 Bad의 발현을 유도한다[12,13]. 따라서 항암 연구에서 caspase의 활성은 항암효과를 나타내는 주요 지표로 간주된다.

해조류(seaweed)는 바다에 사는 식물로 해초라고 불리며, 흡수하는 빛 파장에 의해 갈조류, 녹조류, 홍조류로 분류된다. 해조류는 고단백, 지질, 비타민을 함유하고 있으며 세계 여러 곳에서 인간과 동물 사료 또는 유기 비료로 광범위하게 이용되고 있다[14,15]. 미역(Undaria pinnatifida)은 미역과에 속하는 갈조류로 중국, 일본, 한국 등 아시아 지역에서는 오래 전부터 음식의 재료로 널리 식용되어 왔다. 한방에서는 미역을 해채(海菜), 감곽(甘藿), 자채(紫菜), 해대(海帶)로 불리기도 하며, 동의보감에서는 열이 나면서 답답한 것을 없애고 기가 뭉친 것을 치료하기 위해 사용되어 왔다고 기록되어 있다. 산업적 측면에서 미역은 식이섬유와 단백질이 풍부한 해조류로써 압출 미역 가루를 활용한 고품질의 영양면을 개발하여 소화가 용이한 국수를 제품화하고 있으며, 알긴산나트륨과 염화칼슘의 비즈와 미역을 처리함으로써 활성탄보다 납 이온에 대한 생체흡착능이 5배 우수하여 납 이온 제거를 위한 활용 가능성이 연구되고 있다[16,17]. 미역에는 다당류가 많이 함유되어 있으며 특히 후코이단의 함량이 높아 항산화, 체지방 감소, 항암, 대사증후군 및 골관절염 개선에 효능이 있다고 보고되어 있다[18-21]. 이러한 유용소재 자원을 효율적으로 활용하기 위해서는 미역의 기능성이 면멸히 규명되어야 하며, 다양한 분야에서의 과학적 근거 마련이 필요하다.

본 연구에서는 미역 메탄올 추출물(methanol extract of U. pinnatifida, MeUP)의 인간유래 하인두 편평상피세포암종(FaDu), 편평상피세포암종(YD-10B) 및 인간유래 잇몸 편평상피세포암종(YD-38)에 대한 항암효과와 그 기전을 연구하였다.

미역 메탄올 추출물 제조(MeUP)

미역은 전라남도 완도에서 채취한 것을 구입하여 민물세척 및 건조하였다. 분쇄한 건조미역 50 g을 20배수(v/w)의 메탄올을 이용하여 40°C에서 2시간 추출하였다. 추출물은 0.45 μm pore size의 추출여과지를 이용하여 여과한 후 회전감압농축(Eyela, Tokyo, Japan) 및 동결건조하였다. 추출분말은 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 0.45 μm 필터 후 실험에 이용하였다.

실험 재료

Live/Dead™ Viability/Cytotoxicity kit는 Thermo Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 1차 항체 cleaved caspase-8 (#9748), -9 (#9505), -3 (#9662), poly (adenosine diphosphate ribose [ADP]-ribose) polymerase (PARP, #9532), BID (#8762), Bcl-2 (#15071), 및 Bax (#89477)는 Cell signaling Technology (Danvers, MA, USA), α-tubulin (#322588)은 Invitrogen (Camarillo, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.

세포 배양

FaDu, YD-38 및 YD-10B는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하였다. 대조군으로 사용된 정상세포는 치주인대(periodontal ligament, PDL) 세포로 서린바이오사이언스에서 구입하였다. FaDu는 minimum essential medium (MEM; Welgene, Gyeongsan, Korea)을 이용하였으며 YD-38, YD-10B 및 PDL 세포는 dulbecco’s modified essential medium (DMEM; Welgene, Gyeongsan, Korea)을 이용하여 배양하였다. 배양 배지에는 10% fetal bovine serum과 1% 항생제(100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin)가 함유되어 있으며, 모든 세포는 5% CO₂ 및 37°C 조건하에서 배양하였다.

세포 독성 분석

MeUP에 대한 암세포 및 정상세포의 생존율은 MTT 기법을 이용하여 분석하였다. 세포는 12-well 세포 배양 접시에 well당 2×10⁵개씩 접종하여 overnight 배양한 후, MeUP (0, 0.05, 0.1, 0.2 및 0.4 mg/mL)를 처리하여 24시간 동안 반응하였다. 반응 후, 100 μL의 MTT solution (5 mg/mL)을 첨가하여 4시간 반응한 뒤, 형성된 formazan을 DMSO에 녹여 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. DMSO만 처리한 대조군의 흡광도를 100%로 설정하고 추출물을 처리한 실험군의 흡광도를 비교하여 백분율(%)로 나타내었으며, 생존율 계산식은 다음과 같다.

Cell viability (%)=Means Abs. of the sample-Means Abs. of the blankMeans Abs. of the control-Means Abs. of the blank×100

Dead assay

각 세포를 4-well chamber slide에 1×10⁴개씩 접종하여 overnight 배양한 후, MeUP (0, 0.1 및 0.2 mg/mL)를 처리하여 24시간 동안 반응하였다. 반응 후, 1×phosphate-buffered saline (PBS)에 dead dye를 혼합하여 각 well에 1 mL씩 첨가한 뒤 5분간 반응하였다. 염색된 세포는 형광현미경(Eclipse TE2000; Nikon Instruments, Tokyo, Japan)을 이용하여 죽은 세포(red)를 분석하였다.

단백 발현 분석

세포는 6-well 세포 배양접시에 well 당 4×10⁵개씩 접종하여 overnight 배양한 후, MeUP (0.05, 0.1 및 0.2 mg/mL)를 처리하여 24시간 동안 반응하였다. 반응 후, 부유세포와 부착세포를 모두 수확한 뒤, 1×PBS로 세정한 다음 단백질 추출 용액(iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)을 이용하여 세포를 용해시킨 뒤 총 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 BCA Protein assay (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 정량한 뒤 동량의 단백질(20 μg)을 10% 혹은 14% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis하여 크기별로 분리한 후 polyvinylidene fluoride membrane (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)으로 이동하였다. 비특이적인 반응을 예방하기 위해 5% bovine serum albumin을 이용하여 5분간 반응한 뒤 각종 1차 항체와 함께 overnight 반응하였다. 이후, membrane은 tris-buffered saline (TBS)에 tween-20이 함유된 TBST로 30분간 세척한 뒤, 2차 항체와 함께 상온에서 1시간 반응하였으며, 단백질 밴드 검출을 위해 ECL kit를 이용하여 MicroChemi 4.2 (DNR Bio-imaging systems Ltd., Neve Yamin, Israel)를 통해 가시화하였다.

통계적 유의성

모든 실험결과는 독립적인 3번의 실험을 수행하여 mean±standard deviation으로 나타내었다. 각 실험군 간의 유의성 검정은 GraphPad Prism 5.0 (GraphPad software Inc., San Diego, CA, USA)을 이용하여 one-way ANOVA, Turkey’s t-test를 통해 p-value가 0.05 미만(p<0.05)의 경우에 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

MeUP에 의한 암세포의 증식 억제효과

구강암세포(FaDu, YD-38, YD-10B)와 정상세포(PDL)에 대한 MeUP의 증식억제효과를 분석하기 위해 MTT 기법을 수행하였다. 먼저 추출물을 녹인 DMSO에 대한 세포생존율을 분석한 결과, 정상세포와 암세포의 생존율에는 영향을 미치지 못했으므로 DMSO를 처리한 군을 대조군으로 하여 분석하였다. MeUP는 0.2 mg/mL까지 정상세포의 생존율에는 영향을 미치지 않았으나 암세포의 증식은 농도의존적으로 억제하였다(Fig. 1). 또, MeUP 0.4 mg/mL에서 정상세포는 약 14.3%±2.35%의 세포독성을 보였으며 암세포인 FaDu, YD-38, YD-10B에서는 각각 91.6%±0.7%, 81.1%±4.1%, 72%±4.4%의 증식 억제 효과를 보였다. 특히 MeUP는 FaDu 암세포에 대한 증식효과가 높게 나타났으며, FaDu, YD-38, YD-10B에 대한 MeUP의 IC50값은 각각 0.93 mg/mL, 1.65 mg/mL, 0.24 mg/mL이다. 따라서 이후 실험은 0.05, 0.1 및 0.2 mg/mL로 수행하였다.

Fig. 1. Effect of MeUP on viability of human oral cancer cells, FaDu, YD-38, YD-10B. Cells were treated with 0.05, 0.1, 0.2, and 0.4 mg/mL of MeUP for 24 hours. Cell viability was determined using MTT assay. Results were expressed as a percentage of the control. Data are expressed as means±standard deviation of three independent experiments; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared with the control group. MeUP, methanol extract of Undaria pinnatifida; PDL, periodontal ligament.

MeUP에 의한 암세포의 세포사멸 효과

MeUP에 의한 구강암세포(FaDu, YD-38, YD-10B)의 증식 억제 효과가 세포사멸과 관련이 있는지 분석하기 위해 죽은 세포를 염색하는 EthD-1 형광을 이용하여 분석한 결과, 모든 암세포에서 죽은 세포를 나타내는 붉은 형광이 농도의존적으로 증가하였다(Fig. 2). 이는 MTT 결과와 일치하는 결과로, 다른 암세포보다 FaDu 암세포에서 붉은 형광이 더 많이 나타났다(Fig. 2). 이러한 결과는 MeUP가 구강암세포에 증식억제 효과가 세포사멸과 관련 있음을 시사한다.

Fig. 2. Apoptosis-inducing effect of MeUP on human oral cancer cells, FaDu, YD-38, YD-10B. Cells were treated with 0.1 and 0.2 mg/mL of MeUP for 24 hours. The dead cells were stained by ethidium bromide homodiver-1 (red color), and then stained cells were observed by fluorescence microscopic analysis and imaged (×100). MeUP, methanol extract of Undaria pinnatifida.

MeUP의 death receptor에 의한 외인성 세포사멸관련 단백질 발현 변화 분석

MeUP에 의한 구강암세포(FaDu, YD-38, YD-10B)의 세포사멸이 death receptor에 의해 유도되는지 확인하기 위해 caspase 단백발현 변화를 분석하였다. 그 결과, 3종의 구강암세포에서 MeUP에 의해 외인성 세포사멸 유도인자인 caspase-8이 가수분해되었으며 이후 세포사멸 initiator인 caspase-9와 caspase-3의 가수분해가 유도되었다(Fig. 3). 궁극적으로 DNA 회복기능을 하는 PARP가 가수분해되어 세포사멸이 유도되었다(Fig. 3). 이러한 결과는 MeUP가 외인성-세포사멸 기전을 통해 암세포의 세포사멸을 유도하는 것을 시사한다.

Fig. 3. The expression levels of extrinsic-apoptosis-related protein in MeUP-treated oral cancer cells, FaDu, YD-38, YD-10B. Cells were treated with 0.05, 0.1, and 0.2 mg/mL of MeUP for 24 hours. (A) The expression of apoptosis-related protein, cleaved-8, -9, -3, and PARP. (B-D) Quantitative data of (A) were analyzed using the Image J. Data are expressed as means±standard deviation of three independent experiments; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared with the control group. MeUP, methanol extract of Undaria pinnatifida; Con, control; PARP, polymerase.

MeUP의 미토콘드리아 의존적인 내인성 세포사멸관련 단백질 발현 변화 분석

MeUP에 의한 구강암세포(FaDu, YD-38, YD-10B)의 세포사멸에 미토콘드리아-의존적인 내인성 세포사멸이 관여하는지 분석하기 위해, Bcl-2 family의 단백발현 변화를 분석하였다. 그 결과, 항-세포사멸인자인 Bcl-2의 발현이 농도의존적으로 감소하였으며, 세포사멸 촉진인자인 Bax의 발현이 점차 증가하였다(Fig. 4). 이러한 결과는 MeUP가 외인성-세포사멸 기전뿐만 아니라 내인성-세포사멸 기전을 통해 구강암세포의 세포사멸을 유도하는 것을 시사한다.

Fig. 4. The expression levels of intrinsic-apoptosis-related protein in MeUP-treated oral cancer cells, FaDu, YD-38, YD-10B. Cells were treated with 0.05, 0.1, and 0.2 mg/mL of MeUP for 24 hours. (A) The expression of apoptosis-related protein, Bcl-2 and Bax. (B-D) Quantitative data of (A) were analyzed using the Image J. Data are expressed as means±standard deviation of three independent experiments; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared with the control group. MeUP, methanol extract of Undaria pinnatifida; Con, control; PARP, polymerase.

본 연구에서는 미역 메탄올 추출물(MeUP)의 구강암세포 FaDu, YD-38, YD-10B에 대한 세포 성장 억제 효과와 그 기전을 분석하였다. 미역은 예로부터 뭉친 어혈을 풀고 답답함을 해소하는 민속의약 소재로 오랫동안 사용되어 왔으며, 아시아 지역에서는 음식의 재료로 섭취해왔다. 미역은 체지방감소, 항산화, 항노로바이러스 효과가 있다고 보고되어 있으나 구강암에 대한 효능은 아직 밝혀지지 않았다. 따라서, 본 연구에서는 UP의 구강암에서 항암활성 연구를 위해 에탄올 추출보다 생리활성물질인 비극성 물질이 더 넓은 범위에서 추출될 수 있는 메탄올을 이용하여 추출하였으며, 인간 유래 구강편평상피세포암 FaDu, YD-38, YD-10B의 증식 억제효과 및 그 기전에 대해 분석하였다. 본 연구를 통해 미역 의약 소재로서 활용 가치를 높이고 차후 항암제 개발을 위한 기능성 천연재료로서 가능성을 제시하고자 한다[18,20].

현재 사용되고 있는 항암제의 가장 큰 부작용은 암세포뿐만 아니라 정상세포의 성장에도 영향을 미침으로써 위장장애, 신장기능 감소, 면역력 저하, 골수 기능 저하와 같은 부작용을 초래하는 것이다[22]. 따라서, 정상세포의 성장에는 영향을 주지 않으면서 암세포만을 표적하는 물질의 발굴은 부작용을 감소하고 항암효능을 기대할 수 있으므로 임상적 응용 가치는 매우 높을 것으로 생각된다. 미역 메탄올 추출물은 정상세포로써 이용된 PDL 세포의 성장에는 영향을 주지 않았으며 구강암세포주인 FaDu, YD-38, YD-10B의 증식은 유의하게 억제하였다. 이러한 결과는 다른 암세포주에 대한 미역 추출물의 성장억제효과와 일치하는 것으로, Wu 연구팀[23]은 유방암세포주인 MCF-7에 미역의 황산화 다당류 200 μg/mL를 96시간 처리하였을 때 약 51.4%의 성장 억제효능이 있다고 보고하였으며, Kim 연구팀[24]은 대장암세포주인 HCT-15에 미역 발효 추출물 50 μg/mL를 4일동안 처리하였을 때 약 49.45%의 성장 억제효과가 있다고 보고하였다. 연구에 사용된 암세포주와 추출공정은 모두 다르나 메탄올 추출물의 항암효과가 가장 높게 나온 것은 메탄올의 추출 스펙트럼이 넓으므로 다양한 유효성분이 더 많이 함유되어 있어 항암효능이 높게 나온 것으로 생각된다.

암세포의 세포사멸 유도는 무제한 증식을 억제하기 위한 가장 효과적인 전략으로 간주되고 있으며, 현재 시판 중인 대부분의 항암제들이 이러한 기전을 기반으로 하고 있다[25,26]. 본 연구에서는 MeUP에 의한 구강암세포의 증식 억제 효과가 세포사멸에 의해 매개되는 것을 확인하였으며 그 기전으로 caspase 신호전달과 미토콘드리아-의존성 기전을 분석하였다. Caspase들의 활성은 death-receptor의 리간드 결합을 통한 외인성 경로와 미토콘드리아 외막에 의한 내인성 경로와도 서로 밀접하게 관련되어 있으며, 세포생존에 필요한 요소들을 결핍시킴으로써 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다[27]. Death-receptor를 통한 세포사멸 신호전달은 caspase-8에 의해 유도되며 가수분해된 caspase-8은 미토콘드리아의 tBID의 가수분해를 통해 미토콘드리아-의존성 세포사멸 신호전달 경로가 활성화된다[28]. MeUP는 death-receptor를 통해 caspase-8, caspase-9 및 caspase-3의 가수분해를 유도하였으며 궁극적으로 DNA 회복기능을 수행하는 PARP가 절단되었다. 또 미토콘드리아 외막에서 항세포사멸인자 기능을 하는 Bcl-2의 발현이 감소되었으며 세포사멸촉진인자인 Bax의 발현이 증가하였다. 이러한 결과는 미역 추출물들의 항암 효능 및 기전의 타 연구결과와 일치하는 것으로, 미역 발효 추출물은 대장암세포주(HCT-15)의 세포주기 정지를 유도하여 caspase에 의한 세포사멸을 유도한다고 보고하였으며, Wu 연구팀[23]은 유방암세포(MCF-7)에서 미역 추출물은 colony formation, migration을 억제함으로써 항암활성을 나타낸다고 보고하였다[24]. 특히 미역으로부터 분리한 후코이단에 대한 다양한 효능이 보고되어 있으며, 간암, 대장암, 골육종에 대한 항암효능뿐만 아니라 약물 내성이 있는 폐암세포에 대한 화학 요법 약물의 효과를 향상시킨다고 보고되어 있다[29-31].

본 연구를 통해 구강암세포에 대한 미역의 유의적인 항암활성을 분석하였으나, 미역의 항암소재로서의 활용가치를 높이기 위해서는 다양한 추출공정과 암세포주를 이용한 항암활성 비교분석 및 기전 연구가 이루어져야 할 것이다. 또 미역의 유용성분을 분리하여 기능성을 평가함으로써 화학요법과 병용으로 활용뿐만 아니라 유용성분을 활용한 의약제품 개발 소재로서 그 잠재적 가치를 높일 수 있다.

이 논문은 2021년도 해양수산부 재원으로 해양수산과학기술진흥원의 지원을 받아 수행된 연구입니다(20210656, 빅데이터기반 해양바이러스 제어 및 마린바이오틱스 개발사업).

The authors declare that they have no competing interests.