구강악안면 영역의 감각을 담당하는 삼차신경 감각핵의 일부인 척수감각핵 미측소핵(trigeminal subnucleus caudalis, Vc)은 구강악안면 부위로부터 발생하는 통증 정보를 처리하고 중추로 전달하는 주요 부위이다[1]. Vc는 척수후각(spinal dorsal horn)과 구조와 기능이 유사하여 연수후각(medullary dorsal horn)이라고도 불리우고, 특히, 아교질(lamina II 또는 substantia gelatinosa) 신경세포는 말초의 통각 수용성 신경세포인 일차 구심성 신경세포와 시냅스를 형성하여 말초로부터 오는 통증 신호를 받아 상위 중추로의 전달을 담당하는 핵심적인 부위로 알려져 있다[2,3].

Glutamate는 중추신경계에 가장 풍부하게 존재하는 신경전달물질이며, 통증 경로에서 흥분성 신경전달물질로 작용하여 일차 구심신경 말단에서 이차뉴런으로 통증 신호를 전달하는데 관여한다[4]. 즉, 자극에 의해 통각 수용성 신경세포인 일차 구심성 섬유가 활성화되면 신경 말단에서 시냅스로 glutamate가 방출되고, glutamate에 의해 시냅스후 신경세포의 glutamate 수용체가 활성화되면 신경세포의 탈분극 및 활동전위 생성을 유발시켜 통증 경로를 따라 다른 신경세포 및 상위 중추로 통증 신호를 전달한다[5]. 통증 전달 및 조절에서 glutamate 수용체의 역할이 중요하기 때문에 glutamate 방출 또는 glutamate 수용체 활성 조절은 통증 제어를 위한 치료제 및 치료법 개발에 있어 주요 표적으로 간주되며, N-methyl-D-aspartate (NMDA) 수용체 길항제로 알려진 케타민이나 메만틴 등은 현재 통증 치료에 활용되고 있다[6-8].

파이토알렉신의 일종인 resveratrol (3,5,4'-trihydroxystilbene) (Fig. 1)은 포도류, 딸기류, 견과류 등을 포함한 다양한 식물에서 발견되는 천연 유래 폴리페놀계열 물질로 항산화 효과를 비롯하여 항염증, 항당뇨, 항노화 및 신경보호 등 다양한 생리학적 활성을 가지고 있을 뿐만 아니라[9,10], 통증 조절에 관여하는 다양한 이온 채널과 세포내 신호전달 분자의 발현에 영향을 미침으로써 신경병증성 통증(neuropathic pain) 또는 염증성 통증(inflammatory pain)을 완화시키는 효과를 발휘하는 것으로 나타났다[11-23]. 하지만 구강악안면 부위의 통증 정보의 처리와 전달을 담당하는 연수후각 아교질 신경세포에서 resveratrol에 의한 통증 조절 기전에 대한 연구는 거의 보고된 바 없다. 최근, 뇌절편을 이용한 whole-cell patch-clamp 기법을 통해 resveratrol이 연수후각 아교질 신경세포에서 대표적인 억제성 신경전달과 관련된 GABA 및 glycine 수용체를 매개로 구강악안면 통증 조절에 관여할 수 있음이 보고되었다[24]. 그러나 resveratrol이 연수후각 아교질 신경세포에서 대표적인 흥분성 신경전달물질로 알려진 glutamate 반응성 및 관련된 수용체에 미치는 영향에 대해서는 아직까지 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 뇌절편을 이용한 whole-cell patch-clamp 기법을 통해 resveratrol이 연수후각 아교질 신경세포에서 glutamate 반응성에 미치는 영향 및 그 반응성과 관련된 glutamate 수용체 아형을 규명하고자 하였다.

Fig. 1. Chemical structure of resveratrol.

Chemicals

Resveratrol, glutamate, NMDA, kainic acid (KA) 및 인공 뇌척수액(artificial cerebrospinal fluid, ACSF), 뇌절편 제조 용액(brain slice cutting solution, BSCS) 및 미세유리전극 용액 구성성분은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA)는 Tocris Bioscience (Avonmouth, Bristol, UK) 제품을 사용하였다(ACSF 조성: 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2.4 mM CaCl₂, 1.2 mM MgCl₂, 11 mM D-(+)-glucose, 1.4 mM NaH₂PO₄, and 25 mM NaHCO₃, 0.5 mM C₆H₇NaO₆, BSCS 조성: 208 mM sucrose, 2.5 mM KCl, 0.5 mM CaCl₂, 6 mM MgCl₂, 11 mM D-(+)-glucose, 1.4 mM NaH₂PO₄, 25 mM NaHCO₃, 0.5 mM C₆H₇NaO₆; 미세유리전극 용액 조성: 110 mM CsCl, 30 mM TEA-Cl, 140 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 4 mM Mg-ATP 및 10 mM EGTA. pH 7.3–7.4로 적정하였음). 실험에 사용된 모든 약물들은 특성 및 용해도에 따라 dimethyl sulfoxide (DMSO) 또는 증류수에 녹였으며, 사용 직전에 0.5% 이내 수준에서 ACSF에 희석시켜 관류를 통해 아교질 신경세포에 적용시켰다.

Slice preparation

모든 동물실험은 전북대학교 실험동물 윤리위원회(JBNU 2022-034)의 승인을 받은 후 실온에서 수행되었다. 미성숙 수컷 및 암컷 ICR 마우스(생후 6–20일령)를 사용하였으며, 사육실은 12시간의 주기로 낮과 밤 상태를 유지시켰고, 사료와 물을 제한 없이 공급하였다.

뇌절편 제작과정은 이전 연구와 동일한 방식으로 진행되었다[25]. 마우스를 오전 10시에서 오후 2시 사이에 경추탈골로 희생시킨 후 절두하고 뇌간을 신속하게 적출한 다음 손상을 최소화하기 위해 4°C 이하로 냉각시킨 BSCS에 담가 차가워질 때까지 3–4분간 기다렸다. 뇌간의 등쪽이 위를 향하게 한 상태에서 순간접착제를 이용하여 한천 블록에 빠르게 고정시킨 후 고정된 뇌간 조직을 즉시 BSCS로 채운 절편 제작용 챔버에 옮기고, 진동조직절편기(VT1200S; Leica biosystems, Wetzlar, Germany)를 이용하여 연수후각 부위를 포함한 190–220 μm 두께의 관상 뇌절편을 제작하였다. 31°C로 설정된 항온수조에 미리 비치한 ACSF를 채운 절편 배양용 챔버로 뇌절편을 옮긴 후 손상에서 충분히 회복될 수 있도록 전기생리학적 기록 전 최소 1시간 이상 배양시켰다.

Electrophysiological recording

뇌 절편을 미분 간섭 대비 광학장치가 장착된 정립 현미경(BX51W1; Olympus, Tokyo, Japan)의 재물대에 설치한 기록용 챔버로 옮긴 후 3–4 mL/min 유속으로 산소 포화된 ACSF를 지속적으로 관류하였다. Vc 부위의 아교질 신경세포 영역은 관상 절편의 측면 가장자리를 따라 연수후각 내측에 반투명한 밴드를 형성하고 있어 육안으로 확인이 가능하였다. 외경 1.5 mm, 내경 1 mm의 미세유리관(PG52151-4; WPI, Sarasota, FL, USA)을 Flaming/Brown 유형의 미세유리전극 제조기(P-97; Sutter Instruments Co., Novato, CA, USA)를 이용하여 미세유리전극을 제작한 후 미세유리전극 용액을 채웠으며, 이때 미세유리전극의 팁 저항은 약 4–6 MΩ 범위였다. 미세유리전극을 헤드스테이지에 고정시킨 후 미세조작기를 이용하여 세포 근처까지 접근시켰고 미세유리전극이 세포에 접촉하기 직전 오프셋 전위를 보정하였다. 미세유리전극에 약한 양압을 가한 채로 세포에 접촉시킨 다음 세포가 강하게 부착될 수 있도록 음압을 가하여 gigaseal을 형성하였고, 다시 약간의 음압으로 세포막을 파열시켜 whole-cell mode를 만들었다. 이온통로 활성화에 따른 세포막의 전류 변화를 측정하기 위해 Axopatch 200B (Molecular devices, San Jose, CA, USA)를 voltage clamp mode로 설정하고 –60 mV로 전압을 고정시킨 후 기록을 시작하였다. 수집된 전기생리학적 신호는 1 kHz low pass bessel filter로 여과되었으며, Digidata 1440A (Molecular devices)를 통해 디지털 신호로 변환하여 컴퓨터에 저장 후 분석에 사용되었다.

Statistical analysis

Glutamate를 비롯한 수용체 효능제들(agonists)에 의해 유발된 전류의 크기는 pClamp 10.7 소프트웨어(Molecular devices)를 이용하여 측정되었다. Resveratrol 적용 유무에 따라 효능제에 의해 유도된 전류의 크기 변화를 보여주는 전류 trace 및 그래프는 Origin 2018 (OriginLab Corp., Northampton, MA, USA)을 이용하여 얻었으며, 대응표본 t-검정(paired t-test) 기법을 이용하여 두 집단간 평균을 비교 분석하였다. 모든 통계적 수치는 mean±standard error of the mean으로 표현되었으며, p<0.05를 유의성 있음으로 판정하였다.

본 실험에 사용된 마우스는 21마리였으며, 막전압을 –60 mV로 고정시킨 후 총 36개의 아교질 신경세포에서 전기생리학적 기록을 수행하였다. 또한 glutamate 수용체 활성 시 수반되는 K⁺ 유출로 인한 외향성 전류의 발생을 차단하기 위해 KCl을 CsCl로 대체한 미세유리전극 용액이 사용되었다.

연수후각 아교질 신경세포에 100 μM glutamate를 관류 적용시켰을 때 모든 세포에서 내향성 전류(–95.7±21.1 pA; n=9)가 유발되었다. 동일 세포에 100 μM의 resveratrol을 3분간 전처리한 후 100 μM glutamate를 resveratrol과 동시 적용시켰을 때, 대부분의 세포에서 glutamate 단독 적용 시에 비해 glutamate 매개 반응(–39.7±7.35 pA; n=9)이 유의하게 감소되었다(p<0.01) (Fig. 2A, B).

Fig. 2. Resveratrol (Res) suppressed glutamate (Glu)-mediated currents. (A) A representative trace showing inward currents induced by Glu (100 µM) alone and Glu in the presence of Res (100 µM). Horizontal bars indicate the duration of application. (B) A line series plot showing inward currents induced by application of Glu (100 µM) in the presence or absence of 100 µM Res (Glu, –95.7±21.1 pA; Glu+Res, –39.7±7.35 pA; values represent mean±standard error of the mean; paired t-test; **p<0.01).

Resveratrol이 어떤 유형의 glutamate 수용체에 작용하여 활성을 억제시키는지 알아보기 위해 선택적 glutamate 수용체 효능제로 알려진 AMPA, KA 그리고 NMDA 반응성에 미치는 resveratrol의 영향을 조사하였다. 연수후각 아교질 신경세포에 AMPA 수용체 효능제인 AMPA를 3 μM 농도로 관류 적용시켰을 때, 모든 세포에서 AMPA에 의해 내향성 전류(–120±24.7 pA; n=13)가 유도되었으며, 100 μM resveratrol을 3분간 전처리한 후 3 μM AMPA를 resveratrol과 동시 적용시켰을 때 나타나는 내향성 전류(–116±23.1 pA; n=13)는 AMPA 단독 적용 시와 유의한 차이를 보이지 않았다(p>0.05) (Fig. 3A, B). 또한 KA 수용체 효능제인 KA를 10 μM 농도로 관류 적용시켰을 때, KA는 기록된 모든 세포에 내향성 전류(–71.0±11.0 pA; n=11)를 유발시켰으며, 100 μM resveratrol을 3분간 전처리한 후 10 μM KA를 resveratrol과 동시 적용시켰을 때, KA에 의한 내향성 전류(–64.8±8.94 pA; n=11)는 KA 단독 적용 시와 유의한 차이를 보이지 않았다(p>0.05) (Fig. 4A, B).

Fig. 3. α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA)-induced currents are not affected by resveratrol (Res). (A) A representative trace showing inward currents induced by AMPA (3 µM) alone and AMPA in the presence of Res (100 µM). Horizontal bars indicate the duration of application. (B) A line series plot showing inward currents induced by application of AMPA (3 µM) in the presence or absence of 100 µM Res (AMPA, –120±24.7 pA; AMPA+Res, –116±23.1 pA, values represent mean±standard error of the mean; paired t-test; p>0.05). NS, not significant.

Fig. 4. Kainic acid (KA)-induced currents are not changed by resveratrol (Res). (A) A representative trace showing inward currents induced by KA (10 µM) alone and KA in the presence of Res (100 µM). Horizontal bars indicate the duration of application. (B) A line series plot showing inward currents induced by application of KA (10 µM) in the presence or absence of 100 µM Res (KA, –71.0±11.0 pA; KA+Res, –64.8±8.94 pA; values represent mean±standard error of the mean; paired t-test; p>0.05). NS, not significant.

다음으로, 아교질 신경세포에 NMDA 수용체 공동 효능제인 glycine 1 μM을 지속적으로 공급해주면서 NMDA 수용체 효능제인 NMDA를 30 μM 농도로 관류 적용시켰을 때, NMDA에 의해 모든 세포에서 내향성 전류(–150±29.2 pA; n=12)가 유발되었다. 하지만 동일 세포에 100 μM의 resveratrol을 3분간 전처리한 후 30 μM NMDA를 resveratrol과 동시 적용시켰을 때, NMDA에 의해 유발된 내향성 전류(–80.8±16.9 pA; n=12)는 NMDA 단독 적용 시 나타나는 반응에 비해 유의한 감소를 보였다(p<0.001) (Fig. 5A, B).

Fig. 5. Resveratrol (Res) significantly inhibits N-methyl-D-aspartat (NMDA)-induced currents. (A) A representative trace showing inward currents induced by NMDA (30 µM) alone and NMDA in the presence of Res (100 µM). Horizontal bars indicate the duration of application. (B) A line series plot showing inward currents induced by application of NMDA (30 µM) in the presence or absence of 100 µM Res (NMDA, –150±29.2 pA; NMDA+Res, –80.8±16.9 pA; values represent mean±standard error of the mean; paired t-test; ***p<0.001).

AMPA, KA 및 NDMA와 같은 이온성 glutamate 수용체의 활성은 Na⁺, Ca²⁺과 같은 양전하의 세포내 유입으로 이어지고 그 결과 시냅스후 신경세포막을 탈분극시켜 활동전위를 유발한다[26]. AMPA 및 KA 수용체의 경우 glutamate 단독 결합에 의해서 활성화되어 빠른 흥분성 시냅스후 전위를 중재하지만, 느린 흥분성 시냅스후 전위를 매개하는 NMDA 수용체는 활성화에 glutamate와 glycine 또는 D-serine과 같은 공동 효능제의 결합이 반드시 필요하며, 세포 내 신호전달 경로에도 영향을 줘서 시냅스 가소성, 학습 및 기억 형성에 주로 관여하는 것으로 알려져 있다[4]. 반면 대사성 glutamate 수용체는 G-단백질 결합 수용체로 glutamate 수용체를 비롯하여 2차 전령물질을 통해 세포 내 신호 전달경로를 활성화시킴으로써 느린 시냅스후 전위를 매개한다. 대사성 glutamate 수용체에는 수용체를 구성하는 염기서열 상동성과 관련 세포 신호전달 기전 및 약리적학 특성에 따라 세 개의 그룹으로 구분되며, 세포 내 Ca²⁺의 분비를 증가시켜 신경세포를 흥분시키거나, adenyl cyclase 활성을 억제하여 세포 내 cyclic adenosine monophosphate 농도를 낮춤으로써 신경세포의 활성을 억제하는 효과를 보인다[27].

본 연구에서 resveratrol은 연수후각 아교질 신경세포의 glutamate 매개 전류를 유의하게 억제시켰으며, glutamate 수용체 선택적 효능제인 AMPA 또는 KA 매개 전류에는 영향을 미치지 않았으나 NMDA 매개 전류에는 억제 효과를 나타냈다. 이러한 결과들은 연수후각 아교질 신경세포에서 resveratrol에 의해 glutamate 수용체 활성이 조절될 수 있으며, resveratrol의 glutamate 수용체 활성 조절 기전이 AMPA나 KA 수용체보다는 NMDA 수용체와 관련성이 높다는 점을 시사한다.

몇몇 보고된 연구에 따르면, 본 연구 결과와 유사하게 중추 수준에서 resveratrol이 glutamate 수용체, 특히 NMDA 수용체 활성을 조절할 수 있다는 것을 보여주었다. 예를 들어, Takehana 등[28]은 resveratrol이 척수 삼차신경의 광역동범위(wide dynamic range) 신경세포에서 NMDA 수용체 활성을 억제하여 흥분성 신경전달을 조절할 수 있다고 보고하였으며, 다른 연구에서는 resveratrol의 NMDA 수용체 활성 억제에 따른 Ca²⁺ 유입의 감소가 NMDA 수용체 소단위체 중에서도 subtype 2B에서 가장 강력한 것으로 확인되었다[29]. 또한 해마 절편의 CA1 피라미드 신경세포에서 resveratrol은 glutamate 매개 전류를 용량의존적으로 억제시켰으며, resveratrol에 대한 감수성은 AMPA 수용체보다 KA 수용체 및 NMDA 수용체가 더 높은 것으로 나타났다[30]. 뿐만 아니라 해마 절편의 CA1 피라미드 신경세포를 이용한 다른 연구에서는 resveratrol이 허혈 상태를 유도하여 과도하게 방출된 glutamate에 의해 유발된 자발적 흥분성 시냅스후 전류(spontaneous excitatory postsynaptic currents)의 빈도와 진폭을 현저하게 감소시켰으며[31], 마우스의 대뇌 피질 신경세포에서 NMDA에 의해 유발된 흥분성 field potential의 빈도를 유의하게 억제시켰다[32].

최근 연구들에 의하면, resveratrol이 신경세포에서 NMDA 수용체 활성에 직접적으로 관여하는 것 외에도 다양한 세포 내 경로에 관여함으로써 glutamate 수용체 활성을 조절할 수 있다는 증거들도 제시되었다. 먼저, resveratrol은 glutamate 수용체 활성 조절과 관련이 있는 세포 외 신호조절 인산화효소(extracellular signal-regulated kinase) 및 AMP-활성화 단백질 인산화효소(5' adenosine monophosphate-activated protein kinase), 단백질 인산화효소 C (protein kinase C), sirtuin 경로를 포함한 다양한 세포 신호전달 경로를 활성화하는 것으로 나타났다[21,22,33,34]. 그러나 본 실험 결과와는 대조적으로, resveratrol에 의한 세포 신호전달 경로 활성화 효과를 보고한 일부 연구에서는 resveratrol이 NMDA 수용체 활성 억제가 아닌 적절한 수준의 NMDA 수용체 활성화를 야기시켰으며, 이를 통해 resveratrol이 세포에서 신경보호 효과를 발휘할 수 있음을 암시하였다[35].

또한 resveratrol은 강력한 항산화제로서 glutamate 흥분독성을 유발하는 뇌의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 수준에 영향을 미침으로써 glutamate 수용체의 활성을 조절할 수 있는 것으로 보고되었다[36]. ROS 생성의 증가는 염증, 조직 손상 및 통증 감작과 관련된 다양한 신호 경로를 활성화시키고 이로 인해 NMDA 수용체 활성의 촉진이 야기되어 염증성 통증 및 신경병증성 통증을 유발시킬 수 있으므로, resveratrol에 의한 ROS 생성 억제 효과가 NMDA 수용체 활성의 하향 조절을 유도하여 통증 완화에 기여할 수 있음을 시사한다.

더 나아가, resveratrol이 glutamate 수용체 유전자의 발현을 변화시켜 glutamate 수용체를 조절할 수 있다는 증거도 제시되었다. Karthick 등[37]은 resveratrol이 랫드의 배양된 해마 신경세포에 존재하는 NMDA 수용체 소단위인 NR2B의 발현을 상향 조절시켜 학습 및 기억과 관련된 핵심 과정인 시냅스 가소성을 향상시킬 수 있음을 입증하였다.

한편, resveratrol이 G-단백질 결합 수용체인 대사성 glutamate 수용체에도 영향을 미칠 수 있다는 결과도 보고되었다. Sánchez-Melgar 등[38]은 resveratrol이 NMDA 수용체 활성의 증가에 관여하는 것으로 알려진 제1형 대사성 glutamate 수용체인 mGluR5의 활성을 억제시킴으로써 glutamate 수용체 활성을 조절할 수 있음을 시사하였다.

그럼에도 불구하고 중추 수준에서 resveratrol의 통증 조절 효과는 NMDA 수용체 매개로만 일어나는 것이 아니라 주요 억제성 신경전달물질 수용체인 GABA/glycine 수용체[39,40], 세로토닌 수용체[41], 오피오이드 및 카나비노이드 수용체[42] 등과 같은 통증 조절과 관련된 많은 수용체와 신경전달물질 시스템들에 의해서도 매개될 수 있는 것으로 확인되었기 때문에 다른 통증 조절 시스템과의 복합적인 작용을 통해 효과가 나타날 수 있다는 점도 충분히 고려해야 한다. 실제로 아교질 신경세포를 이용한 이전 연구에서는 resveratrol이 glutamate 수용체가 아닌 GABA/glycine 수용체 활성화를 통해 직접적으로 구강악안면 통증 조절에 관여할 수 있음을 시사하였다[24].

종합적으로 본 연구는 resveratrol이 중추 수준에서 glutamate 수용체 활성을 억제함으로써 구강악안면 통증 정보 조절에 일부 기여할 수 있으며, 구체적으로 resveratrol의 구강악안면 통증 정보의 조절이 non-NMDA glutamate 수용체인 AMPA/KA 수용체보다는 NMDA 수용체 활성 억제를 통해서 유도될 수 있음을 시사하고 있다. 그러나 resveratrol이 통증을 조절하는 경로는 매우 다양하고 복잡할 뿐만 아니라 수용체의 종류 및 아형, resveratrol의 용량, 실험에 사용된 세포 유형 및 뇌 영역 등 실험조건에 따라 그 효과가 다르게 나타날 가능성이 매우 높다. 따라서 resveratrol이 구강악안면 부위의 통증 조절을 표적으로 하는 후보물질로 확립되기 위해서는 세포 및 전임상 수준에서 resveratrol과 glutamate 수용체 사이의 상호작용을 충분히 이해하기 위한 심층적인 연구가 요구된다.

This work was supported by the National Research Foundation of Korea (NRF) grant funded by the Korea government (MSIT) (No. 2021R1F1A1046123) and (No. 2021R1F1A 1045406).

The authors declare that they have no conflicts of interest.