구강악안면영역에서 외상이나 치아발치 외에도 다양한 병발요소들이 악골이나 치조골의 결손을 일으키고, 그 결과 기능적, 심미적인 장애가 발생한다. 이러한 악골 및 치조골의 결손부를 수복하기 위해서 다양한 수술 기법들과 함께 골 이식 재료나 골 형성 유도물질들이 연구되어 임상에서 적용되고 있다. 치과 관련 외래 수술에서 가장 일반적으로 구사되는 기법은 합성골이나 이종골, 또는 동종골을 이용한 골유도 재생술(guided bone regeneration), 자가골 이식술, 그리고 혈소판풍부 피브린(platelet rich fibrin)이나 골형성단백과 같은 골 형성 유도물질의 적용이다[1-3].

최근에는 lidocaine-fibrinogen-aprotinin (LFA) 콜라겐을 조합한 제제를 비스포스포네이트 관련 악골괴사에 의한 골 결손부의 치료에 적용한 임상증례가 보고되었다[4]. LFA 콜라겐은 골 결손부위에 콜라겐 섬유와 피브린 섬유로 구성된 그물망(network) 구조를 형성하여 지지체(scaffold)로 작용함으로써, 세포와 생리활성물질들이 지지체 내에서 장기간 유지될 수 있도록 함과 동시에 그물망 구조의 지지체에 골모세포를 정착시켜 콜라겐을 생성하고 석회화 과정을 통해 피질골의 생성을 촉진할 수 있도록 하는 역할을 하는 골이식 재료이다. 이를 기반으로 상품화한 Osscore (Denhouse, Jeongeup, Korea)는 lidocaine-maltodextrin-thrombin (LMT) 콜라겐으로, 1형 콜라겐과 말토덱스트린, 트롬빈이 포함된 골형성 재료로, 위에서 언급된 LFA 콜라겐과 유사한 기전으로 골 결손부에 복합적인 지지체를 형성하여 골조직 재형성을 유도한다.

하지만 이 LMT 콜라겐과 관련해서는 아직은 충분한 연구와 임상증례가 보고되지 않았다. 이에 본 연구에서는 백서 두정골의 골 결손부 모델을[5] 사용하여, LMT 콜라겐이 신생골 형성에 미치는 영향을 실험적으로 검증하고자 하였다.

실험동물

36마리의 10주령 된 수컷 백서(Sprague Dawley, body weight 350-380 g)가 사용되었다. 백서들은 실험에 앞서 새로운 환경에서 1주일 간의 적응기간을 거쳤다. 또한, 이 연구는 강릉원주대학교(Gangneung-Wonju National University, Gangneung, Korea) Institutional Animal Care and Use Committees의 승인(GWNU-2020-2) 후에 진행되었다.

수술 과정

백서의 두정부를 povidone-iodine 용액으로 소독한 후, 1:100,000 에피네프린이 포함된 2% 리도카인으로 침윤마취를 시행하였다. 15번 블레이드로 골막까지 절개한 후, 두개골이 노출되도록 박리를 시행하였다. 백서 두개골 정중 봉합부에 trephine bur를 사용하여 직경 8 mm의 원형 골창을 형성하였고, 이렇게 형성된 골 결손부를 아래와 같이 12마리씩 처치하였다.

(1) 1군: 골 결손부에 아무런 처치를 하지 않고 그대로 봉합.

(2) 2군: 골 결손부에 콜라겐 플러그만 삽입 후 봉합.

(3) 3군: 골 결손부에 LMT 콜라겐을 적용한 콜라겐 플러그를 삽입 후 봉합.

콜라겐 플러그는 Ateloplug (Bioland, Cheonan, Korea)를 미리 균일 규격(0.01 g)의 1조각으로 준비하여 골 결손부 당 1조각씩 적용하였다. LMT 콜라겐은 시판되는 Osscore (Denhouse)를 제품의 표준 사용방법에 따라 적용하였다. 즉 제품에 동봉된 트롬빈을 2% 리도카인(1:100,000 에피네프린) 0.5 mL와 혼합하여 용해한 후, 이 혼합용액에서 0.2 mL를 채취하여 1형 콜라겐 1 mL와 혼합하여 LMT 콜라겐을 만들었다. 이렇게 조합된 LMT 콜라겐에서 0.1 mL를 채취하여 미리 준비된 콜라겐 플러그에 5분간 적용시킨 후 골 결손부에 삽입하였다. 모든 군에서 골 결손부의 처치가 종료된 후, 4-0 바이크릴과 4-0 실크로 층별 봉합을 시행하였고, 항생제와 진통제를 0.1 mL씩 근육 주사하였다. 수술 4주 후에 군당 6마리를 무작위로 골라 희생시킨 후, 디스크를 사용하여 골 결손부 전체가 포함되도록 두개골 부위 표본을 채취하였다. 이때 결손부의 잔존 이식재들이 떨어지지 않도록 두개골 표본에서 골막과 피부를 박리하지 않고 함께 채취하였다. 또한, 수술 8주 후에 나머지 6마리의 백서를 희생하여 동일한 방법으로 두개골 표본을 채취하였다. 채취된 표본은 10% 포르말린 용액에 담가 보관하였다.

Micro-computed tomography (μ-CT) 분석

μ-CT는 SkyScan1173 (ver. 1.6.0; Bruker, Kontich, Belgium)을 이용하여 이미지를 스캔한 후 Nrecon (ver. 1.7.0.4; Bruker) 프로그램으로 분석하였다. 관심부위(region of interest, ROI)는 최초 형성했던 골 결손부의 크기와 형태를 일치시켜서 설정하였다. 그리고 각 시편의 ROI에서 관찰되는 방사선 불투과상을 신생골로 상정하고, 이 신생골의 부피를 분석 프로그램으로 측정하였다.

조직형태학적 분석

μ-CT 분석 후에 시편들을 에탄올로 탈수하고 5% 질산으로 탈회한 후 원형 결손부의 정중부 횡단면을 파라핀 블록으로 제작하였다. 파라핀 블록을 절단하여 hematoxylin-eosin (H&E) 염색과 Masson’s Trichrome (MT) 염색(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 프로토콜에 따라 시행하였다. 염색된 모든 슬라이드는 디지털 카메라(DP-20; Olympus, Tokyo, Japan)를 사용해 디지털 이미지로 만들어 분석하였다. 또한, SigmaScan Pro (SPSS, Chicago, IL, USA) 소프트웨어를 이용하여 MT 염색 표본에서 골 결손부의 신생골 면적을 측정하였다. 먼저 디지털 이미지에 표시되어 있는 1 mm 스케일 바를 이용하여 프로그램의 calculate를 시행한 후, 최초로 형성하였던 골 결손부의 범위를 설정하였다. 그리고 결손부에 새로 형성된 골조직의 면적을 측정하였다. 이어서 골 결손부의 전체면적을 측정한 뒤, 전체 골 결손 면적에 대한 신생골의 면적으로 골 형성 비율(%, 신생골의 면적/골 결손부의 면적×100)을 계산하였다.

통계

데이터 값은 IBM SPSS Statistics Subscription (IBM Co., Armonk, NY, USA) 통계 프로그램으로 분석하였다. 3개 군 사이의 신생골의 평균 부피와 면적, 그리고 골 형성 비율의 측정값을 비교하기 위해 비모수적 분석법인 Kruskal–Wallis test를 사용하였고, 이후 사후분석을 위해서 다시 2개 군 사이의 차이를 Mann-Whitney U-test를 사용해 분석하였다. 모든 통계결과의 신뢰도 값은 p<0.05이다.

μ-CT 평가

시편들의 μ-CT 이미지(Fig. 1)에서 계측한 신생골의 부피에 대한 군별 평균값은 Table 1과 같다. 수술 4주 후에는 각 군 사이에 유의한 차이가 없었다(p=0.203). 반면에 수술 후 8주에 3군에서 측정된 신생골의 부피는 1군(p=0.026) 및 2군(p=0.041)과 비교하여 유의하게 증가되었다. 또한, 1군(p=0.041)과 3군(p=0.015)은 4주째와 비교하여 8주째에서 신생골의 부피가 유의하게 증가하였지만, 2군(p=0.180)에서는 유의한 증가가 관찰되지 않았다.

Fig. 1. (A) Micro-computed tomography (μ-CT) scan image. Group 1 is sutured again without any treatment on the bone defect. In Group 2, insert only the collagen plug into the bone defect, and in Group 3, insert the collagen plug soaked with lidocaine-maltodextrin-thrombin (LMT) collagen. 4 weeks after surgery, 6 animals were sacrificed in each group, and then samples of the skull area were collected and subjected to μ-CT. (B) μ-CT scan image. Group 1 is sutured again without any treatment on the bone defect. In Group 2, insert only the collagen plug into the bone defect, and in Group 3, insert the collagen plug soaked with LMT collagen. 8 weeks after surgery, it proceeded in the same way as above.

H&E 염색 소견

H&E 염색 결과 골 결손부에 골조직이 다양한 정도로 형성된 것을 관찰할 수 있었다. 즉 μ-CT 이미지에서 골 결손부의 방사선 불투과상이 증가한 양상을 보여주는 시편의 조직소견에서 골 결손부에 골의 양이 증가된 조직소견을 보여주었다. 특히 8주차의 3군에서 다른 군과 비교하여 신생골의 증가가 뚜렷하게 관찰되었다(Fig. 2A). 또한, 3군의 4주째의 시편들에서는 다른 군들의 시편들과는 달리 골 결손부에 이식한 콜라겐 플러그가 남아있는 것이 관찰되었다(Fig. 3).

Fig. 2. (A) Histological image of calvarial samples. Empty group is Group 1. Collagen plug only group is Group 2, and collagen plug+lidocaine-maltodextrin-thrombin (LMT) collagen group is Group 3. Image of hematoxylin-eosin (H&E) staining (×12.5). (B) Histological image of calvarial samples. Empty group is Group 1. Collagen plug only group is Group 2, and collagen plug+LMT collagen group is Group 3. Image of Masson’s Trichrome (MT) staining (×12.5).

Fig. 3. (A) Hematoxylin-eosin (H&E) staining and (B) Masson’s Trichrome (MT) staining (left, ×12.5; right, ×100) image of group 3 after 4 weeks. It can be observed that the implanted collagen plug still remains in the bone defect.

MT 염색 소견

골 결손부에 형성된 신생골의 골조직 양상을 MT 염색을 통해 확인하였다(Fig. 2B). 성숙골과 함께 미성술골이 혼재된 양상이 관찰되었고, 특히 수술 8주 후의 3군 시편에서 성숙골이 다른 군들보다 뚜렷하게 관찰되었다. 즉, MT 염색 슬라이드에서 측정한 신생골의 평균 골 면적과 평균 골 형성 비율은 Table 2 및 3과 같다. 4주 표본에서 평균 신생골의 면적(p=0.719)과 평균 골 형성 비율(p=0.983)에서 3개 군 간에 유의한 차이는 없었다. 반면에 8주 표본에서는 평균 신생골의 면적과 평균 골 형성 비율에서 3개 군 간에 유의한 차이가 관찰되었다. 특히, 1군과 2군 사이에서는 8주째에서 평균 신생골의 면적(p=0.937)과 평균 골 형성 비율(p=0.699)에서 유의한 차이는 없었지만, 3군의 경우 평균 신생골의 면적과 평균 골 형성 비율이 1군(p<0.01, p<0.01) 및 2군(p<0.01, p<0.01)과 비교하여 유의하게 증가하였다.

골조직은 세포요소, 체액요소, 그리고 물리적 요소들의 상호작용으로 형성되고, 이 현상은 골 치유나 골 재생 과정에서도 동일하다. 골 재생 시, 다양한 국소 단백질들이, 골형성 세포나 미분화 줄기세포가 골 결손부위로 이동하도록 유도한 뒤 골모세포로 분화하도록 지시하는데, 이것이 체액요소이다. 그리고 골모세포가 골조직을 형성하는 것이 세포요소이고, 이러한 골모세포가 물리적 기질인 지지체를 따라 이동하면서 그 공간 내부로 침착하는 것이 물리적 요소이다[6,7]. 세포요소는 주로 골형성(osteogenesis) 능력을, 체액요소는 골유도(osteoinduction) 능력을, 그리고 물리적 요소는 골전도(osteoconduction) 능력을 반영하며, 골 결손부를 재생하기 위해 이용되는 골이식재들은 이러한 능력들 중 일부나 전부를 지니고 있다[8].

자가골은 위의 세 가지 능력을 모두 가지고 있어 골재생 효과가 좋고, 환자 친화적이며 치유속도가 빠르다. 하지만 자가골 이식술은 이식골의 채취를 위한 추가적인 수술부위를 형성해야 하는 단점이 있고, 그로 인해 환자의 불편감, 수술시간, 합병증이나 부작용의 발생 가능성이 증가하게 된다. 이와 같은 불편감을 해결하기 위하여 동종골이나 이종골의 다양한 골이식재가 개발되어 사용되어 왔고, 현재 치과 임상에서 가장 많이 사용되고 있는 것이 탈단백 우골(deprotenized bovine bone mineral, DBBM)을 이용한 이종골이다. DBBM은 주로 골전도 능력을 지닌 이식재로 자가골에 비해 골형성 능력은 떨어지고, 감염과 이물반응의 위험이 증가한다. 따라서 최근에는 bone morphogenetic protein type 2 (BMP-2) 등의 골 형성에 관여하는 단백질들이 추가적으로 사용하는 것이 추세인 바, BMP-2는 체액요소로써, 골유도 능력을 증대시켜서 골의 재생을 촉진하게 된다[9].

LMT 콜라겐은 물리적 요소와 체액요소를 지닌 이식재료로, 본 연구에서는 시판되고 있는 Osscore를 사용하였다. LMT 콜라겐의 구성요소들에서, 1형 콜라겐은 골세포의 기질을 생산하는데 중요한 역할을 하는 단백질로 골의 주성분이 된다. 또한, 몇몇 연구에서 골모세포의 분화와 부착을 촉진시키는 역할을 하는 것으로 보고되었다[10-12]. 그리고 세포 외 콜라겐 매트릭스의 침착은 콜라겐 섬유가 세포 수용체인 인테그린과 상호 작용하여 골 관련 유전자의 전사를 자극하는 신호 전달을 시작하기 때문에 골형성 조절과정의 중요한 과정이 된다[13,14]. 말토덱스트린은 소량의 글루코스와 말토스(maltose)로 구성된 d-글루코스 다당류로, 상처의 치유과정에서 치유력을 향상시키고, 감염 가능성을 줄일 수 있는 치유물질로서 주목을 받고 있다[15]. 또한, 말토덱스트린은 섬유아세포의 대사를 자극함으로써 콜라겐 전환을 촉진하여 콜라겐 섬유를 증가시키는 것으로 보고된 바 있다[16].

트롬빈은 혈전 형성 과정 중에 피브리노겐을 피브린으로 변화시키는데, 이때 낮은 트롬빈 농도 하에서 형성된 혈전은 두꺼운 피브린 섬유로 구성되며 섬유소 용해(fibrinolysis)에 매우 민감한 반면, 높은 트롬빈 농도 하에서 형성된 혈전은 얇은 섬유로 구성되고 섬유소 용해에 비교적 내성이 있다고 보고되었다[17,18]. 또한, 트롬빈은 내피세포 표면수용체인 thrombomodulin과 복합체를 형성하여 단백질 C를 활성화 단백질 C (activated protein c, APC)로 변화시키고, 이 APC가 Factor Va와 Factor VIIIa를 억제하여 항응고 작용을 일으킨다. 그리고 동시에 피드백 억제 기전으로 트롬빈의 생산이 감소되어[19,20], 응고 작용은 저해되고 항응고 작용이 나타나게 된다. 따라서 이식 초기에 Osscore와 함께 사용된 트롬빈이 고농도 환경을 만들어 피브린 그물망의 형성을 더욱 촉진하게 된다.

그리고 리도카인은 아미드형 국소마취제로, 지용성 단백질과의 결합능력이 높기 때문에 콜라겐 단백질을 잘 용해시키는 특징을 가지고 있어 용매제로서도 사용이 가능하다. 그리고 리도카인을 용매로 사용하는 경우에 추가적으로 수술이나 염증에 의한 동통의 발생을 감소시킬 수 있으며, 콜라겐 용액의 경우 산성을 띄는 경우가 많은데 이러한 산성도를 중성화시키는 역할을 하게 된다.

위와 같은 구성 성분들의 상호작용으로, LMT 콜라겐을 골 결손부에 적용시키면 콜라겐 섬유가 트롬빈 유도로 형성된 피브린 그물망과 결합되어 콜라겐-피브린 그물망을 형성하게 되고[21,22], 그물망에 세포나 싸이토카인이 정착되면서 지지체 내에서 보다 오래 유지될 수 있도록 한다[9,23]. 이는 3군의 4주째 슬라이드에서 이식했었던 콜라겐 플러그가 다른 군과는 달리 여전히 남아있는 것을 통해 알 수 있다(Fig. 3). 이때 피브린과 콜라겐이 어떻게 상호작용하는지는 아직 명확하게 보고된 바는 없지만, 지금까지의 연구에서 피브린과 콜라겐 사이의 공유 가교 결합을 형성하는데 있어서 Fcator XIIIa의 역할이 언급되기도 하였다[24,25]. 이처럼 물리적 요소와 함께 콜라겐과 피브린 단백질이 체액요소를 수행하게 되고, 더욱이 이 콜라겐-피브린 그물망에 부착되는 단백질들이 더욱 체액요소를 보강하게 된다.

본 연구에서는 백서의 두개골 결손부에 LMT 콜라겐을 적용한 콜라겐 플러그를 삽입한 경우, 콜라겐 플러그만을 삽입한 경우와 아무런 처치를 하지 않은 경우를 비교해서 신생골의 형성정도를 관찰하였는데, 골 결손부에서 관찰되는 신생골의 평균 부피와 횡단면의 평균 골 면적을 측정한 값은 4주째에서는 각 군 간에 유의한 차이가 없었지만, 8주째의 골 부피와 골 면적의 평균값이 3군에서 유의하게 증가하였다. 따라서 LMT 콜라겐이 신생골의 형성에 기여한다는 것을 알 수 있었다. 또한, 3군의 4주째 슬라이드에서 콜라겐 플러그가 여전히 남아있고, 4주까지는 유의한 차이가 없었지만, 8주째에서 차이가 나타나는 것을 통해, 4주가 경과하고서도 LMT 콜라겐이 신생골 형성에 지속적으로 영향을 주었을 것으로 추정해 볼 수 있을 것이다. 그리고 1군과 2군의 신생골의 부피가 4주와 8주에서 각각 군간에 유의한 차이는 없었지만, 1군보다는 2군의 평균값이 더 많았는데, 1군은 4주에 비해 8주에서 유의한 증가가 보이지만, 2군은 4주와 8주간에 유의한 변화는 보이지 않았다. 이는 콜라겐 플러그만 적용한 경우 최종적인 골형성의 증가에는 그리 영향을 주지 못했지만, 초기 골형성을 촉진한 것으로 판단된다.

본 연구는 동일 개체에서 지속적인 변화를 파악한 것이 아니라 개별 개체에서의 결과를 보았기 때문에 개체간의 차이가 주는 영향을 무시할 수 없고, 이 차이를 충분히 반영할 수 있을 만큼의 실험 샘플의 수를 확보하지 못했다는 한계도 있다. 즉, 본 연구에서처럼 4주, 8주 후에 각각 실험동물을 희생시키지 않고, 1주부터 8주까지 1주일 간격으로 백서의 골 결손부위를 CT 스캔하여 동일 개체에서의 시간 경과에 따른 신생 골 형성을 관찰하는 방법을 고안할 수도 있을 것이다. 또한, 본 연구에서는 적용의 편리함 때문에 콜라겐 플러그를 사용하였지만, 실제 임상에서 다양한 골 이식재료들과 함께 적용하여 사용할 수 있을 것이다. 혹은 콜라겐 플러그 이외의 다른 지지체를 사용하거나, 최근 다양하게 이용되고 있는 3D printed customized implant로 골 결손부를 재건하는 경우 함께 사용할 수도 있을 것이다[26,27].

결론적으로, LMT 콜라겐을 적용한 콜라겐 플러그를 골 결손부에 적용하였을 경우, 아무 처치를 하지 않은 경우나 콜라겐 플러그만을 적용한 경우와 비교해서 신생골의 부피와 골 형성 비율이 4주 표본에서는 각 군 모두에서 유의한 차이가 보이지 않았지만, 8주 표본에서는 LMT 콜라겐을 적용한 콜라겐 플러그를 골 결손부에 적용한 3군이 다른 군들과 비교하여 유의하게 증가한 것을 알 수 있었다. 이는 LMT 콜라겐과 지지체로 기능할 콜라겐 플러그의 조합이 골 결손부에서 4주가 지나고 나서도 골 형성에 지속적으로 영향을 준 것으로 판단되고, 따라서 골 결손부의 수복에 있어서 다양한 가능성과 선택지를 임상가에게 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

This work was supported by the National Research Foundation of Korea (NRF) grant funded by the Korea government (MSIT) (No.2018R1C1B5086579).

The authors declare that they have no competing interests.