활성산소종은 인체에서 지속적으로 형성되며, 담배연기, 질소산화물, 오존, 대기오염물질 등 여러 요인들이 산화적 스트레스를 가중시킨다. 효소를 포함하는 다양한 항산화 방어는 활성산소종을 효과적으로 방어하지만 한계가 있다. 활성산소종은 인체의 DNA, 지질, 단백질에 대한 산화 손상을 야기하여 암을 포함하여 뇌질환, 심장질환, 염증 등의 발병에 관여한다[1,2]. 암은 통제되지 않은 세포 성장을 특징으로 하며 세계적으로 주요 사망 원인이다[3,4]. 화학 요법은 암에 대한 가장 일반적인 치료법 중 하나이지만, 여러 가지 심각한 부작용을 유발하며 더욱이 치료 중 약물에 대한 내성이 생길 수 있다. 이러한 약물 내성은 암 환자의 치료 실패로 인한 사망의 주요 원인이 된다[5,6]. 대부분의 화학 요법 제제는 세포사멸을 유도하지만 많은 유형의 암이 이것의 회피를 통해 내성을 갖게 됨으로써 암세포의 생존, 재발 및 화학 요법의 제한된 효과의 주요 요인이 된다[7,8]. 더욱이 화학 요법 제제는 정상세포에 영향을 미치는 세포 독성을 가지고 있다[9,10]. 임상에서 사용되는 약물의 약 25%와 항암제의 60% 이상이 식물에서 추출된다[11,12]. 이러한 식물 유래 약물은 낮은 세포 독성과 보다 증가된 항암 활성을 갖고 있어 신약 개발을 위한 좋은 소재가 된다[13,14]. 동백나무과(Theaceae), 동백속(Camellia)에 속하는 상록교목인 동백나무(Camellia japonica L.)는 우리나라의 전남 지역이 전국 식재 면적의 67%를 차지하고 있으며[15], 주로 조경수나 관상용으로 이용되고 있고, 동백 종실은 식용유와 화장유, 줄기는 고급 숯, 잎은 차의 재료로 이용되었다고 알려져 있다[16]. 또한 동백 잎은 건선, 인후통증, 화상에 효능이 있고, 가지와 열매는 머리비듬, 비출혈, 어혈, 연골증, 월경이상, 이뇨, 인후통증, 장출혈, 종독, 출혈, 타박상, 토혈과 각혈, 행혈, 화상 등에 효능이 있는 것으로 알려져 있다[17]. 동백나무 추출물에 관한 연구로는 항산화 활성[18], 항균 활성[19], 항전이 활성[20,21], 항알레르기 반응[22], 항염증[23], 항광노화[24]와 같은 다양한 생물학적 활성을 가지고 있으나, 이에 대한 연구들은 일반적으로 잎, 꽃 또는 기름을 사용하여 수행되었다. 동백나무의 열매 추출물은 항동맥경화 활성[25], 심혈관 보호 효과[26], MAPK/NF-kB 신호 전달 경로 억제를 통한 위장 보호 및 상처 치유 촉진 효과[27], 백혈병 세포에서 항암 활성[28]에 대한 연구가 보고되었으나, 동백나무 열매의 생리 활성에 대한 연구는 여전히 부족한 실정이다. 따라서 본 연구는 발효 동백나무 건조 과피 추출물 및 발효 추출물의 구강암 세포에서 새로운 암 치료원으로서의 가능성과 생리활성을 규명하는 것을 목적으로 하여 국내 자생 식물의 활용 가치를 증진함과 동시에 고부가가치성 식품 개발을 위한 기초자료로 활용하고자 한다.

추출 및 발효

동백나무 열매는 전라남도 완도 군외면 삼두리(동경 126° 6680.07″, 북위 34° 3464.90″)에서 채취하였다. 건조된 동백 과피를 분쇄기(SMX-C4000WK; Shinil Co., Incheon, Korea)를 사용하여 분말로 분쇄하였다. 분쇄된 분말 2 g을 250 mL 삼각 플라스크에 40 mL의 증류수와 혼합하고, 121°C에서 15분 동안 멸균한 다음 30°C 이하로 냉각시켰다. 각 삼각 플라스크에 0.1%–0.3%의 황국균(Aspergillus oryzae; Chungmoo Fermentation Co., Ltd., Ulsan, Korea) 분말을 첨가한 다음 30°C 또는 35°C에서 120 rpm의 진탕 배양기에서 3일 동안 배양하거나 시간별(24, 48, 72시간) 배양하였다. 발효 생성물을 50 mL 원심 분리 튜브에 옮기고 2,600 ×g에서 20분 동안 원심분리하였고, 상층액을 여과하고 새로운 50 mL 원심 분리 튜브로 옮기고 –72°C에서 보관하였다. 24시간 후 황국균 발효 추출물(Aspergillus oryzae fermentation extract, AOF)을 동결 건조기를 사용하여 동결 건조하였다.

DPPH 라디칼 소거능 측정

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼에 대한 소거능을 측정하기 위해 변형된 Blois의 방법[29]을 이용하였다. 추출물을 0, 62.5, 125, 250 μg/mL로 희석하고 0.5 mM DPPH와 함께 96-well plate의 well당 각각 0.1 mL를 넣고 실온에서 30분 동안 암반응한 다음 분광광도계(OASYS UVM 340; Biochrom, Cambridge, UK)를 사용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 추출물 미첨가군을 대조군으로 하여 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 구하였다.

총폴리페놀/플라보노이드 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 방법[30]을 변형하여 측정하였다. 표준물질로 gallic acid를 사용하였고, 0, 62.5, 125, 250, 500 μg/mL로 희석하여 준비하였다. 96-well plate에 희석된 gallic acid와 1 mg/mL의 추출물을 well당 각각 0.1 mL를 넣고 0.1 mL 0.04 N Folin-Ciocalteu’s reagent와 0.1 mL 1% Na²CO³를 가한 후 1시간 동안 암반응시킨 후 분광광도계(OASYS UVM 340; Biochrom)를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 표준물질인 gallic acid로부터 얻은 검량곡선을 이용하여 구하였다. 총 플라보노이드 함량은 Moreno 등[31]의 방법을 변형하여 측정하였다. 표준물질로 quercetin을 사용하였고, 0, 62.5, 125, 250, 500 μg/mL로 희석하여 준비하였다. 96-well plate에 희석된 quercetin과 1 mg/mL의 추출물을 well당 각각 20 μL를 넣고 5 μL 10% aluminum nitrate와 5 μL 1M potassium acetate를 가한 후 270 μL ethanol을 더하여 혼합하고 실온에서 40분 동안 암반응시킨 뒤 분광광도계(OASYS UVM 340; Biochrom)를 사용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 표준물질인 quercetin을 이용하여 얻은 검량곡선으로부터 구하였다.

세포배양

본 연구에 사용된 사람 배아 신장 세포주 293T는 DMEM 배지에, 사람 구강암 세포주 YD-8과 YD-10B는 RPMI 1640 배지에 10% fetal bovine serum과 1% penicillin/streptomycin을 첨가하여 사용하였고 37°C, 5% CO² 조건의 인큐베이터에서 배양하였다. 세포주는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)으로부터 구입하였다.

세포독성 측정

48-well plate에 well당 5×10⁴의 세포를 분주한 다음 18시간 동안 배양 후 추출물을 0, 125, 250, 500 μg/mL의 농도가 되도록 처리하고 48시간동안 반응시켰다. MTT 용액(5 mg/mL)을 50 μL 가하고 4시간 후 상층액을 제거하고 DMSO 200 μL를 넣어준 후 교반기에서 30분간 암반응시켰다. 생성된 formazan으로부터 용출된 용액을 분광광도계(OASYS UVM 340; Biochrom)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

단백질 발현 분석

1.6×10⁵ 세포를 100 mm 세포 배양 접시에 접종하고 18시간 배양한 후, 추출물을 세포에 0, 125, 250, 500 μg/mL의 농도가 되도록 처리하고 48시간 후, 세포를 phosphate buffered saline (PBS)으로 세척한 후 protease inhibitor cocktail III (ProGEN, Gwangmyeong, Korea)를 함유한 RIPA 완충액(Biosolution Co., Ltd., Seoul, Korea)에 용해시켰다. 세포 용해물을 4°C에서 20분 동안 16,000 ×g에서 원심분리하고, 상층액을 단백질 발현 분석에 사용하였다. Pierce™ Rapid Gold BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 단백질 농도를 정량화하였고, 단백질(50 μg)을 SDS-PAGE 겔에서 전기영동으로 분리하고 PVDF membrane (Millipore, Bedford, MA, USA)으로 옮겼다. Membrane을 5% 탈지유를 함유한 TBST로 실온에서 1시간 동안 반응시킨 다음 PARP (#9542, 1:1000), cleaved-caspase3 (#9664, 1:1000), β-actin (#3700, 1:5000)에 대한 1차 항체와 함께 4°C에서 18시간 반응시켰다. Membrane을 TBST로 4회 세척하고 2차 anti-mouse HRP (#7076, 1:5000) 및 anti-rabbit HRP 항체(#7074, 1:5000)와 함께 반응시켰으며, 모든 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. Amersham ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시약(RPN2106; GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)을 검출에 사용하였고, 밴드 이미지는 Fusion Solo 이미징 시스템(Fusion SOLO; Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée, France)을 사용하여 획득하였다.

Arthur image-based cytometirc assay

1.6×10⁵ 세포를 100 mm 세포 배양 접시에 접종하고 18시간 후, 추출물을 세포에 0, 125, 250, 500 μg/mL의 농도가 되도록 처리하고 48시간 후, 세포를 PBS로 세척한 후 trypsin-EDTA 용액으로 처리하였다. 수확 후, 세포를 차가운 PBS로 세척하고 1× annexin 결합 완충액에 재현탁시켰다. 각 100 μL의 세포 현탁액을 5 μL Alexa Fluor 488 annexin V 및 1 μL 100 μg/mL PI 용액(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)과 함께 실온에서 15분 동안 반응시켰다. 준비된 샘플을 Arthur 이미지 기반 세포분석기(NanoEnTek Inc., Seoul, Korea)를 사용하여 분석하였다.

통계처리

모든 결과는 student’s t-검정을 통해 쌍체비교로 통계적 유의성을 p<0.05 수준에서 검증하였고, 평균±표준편차로 나타내었다.

항산화 활성

30°C에서 동백 건과피의 황국균 농도별 발효 추출물(AOF)의 농도별 항산화 활성을 측정한 결과 62.5, 125, 250 μg/mL에서 AOF 0.1%의 경우 각각 38.23%±0.86%, 56.69%±0.82%, 59.94%±1.19%, AOF 0.2%의 경우 각각 42.49%±1.22%, 61.14%±1.15%, 63.51%±1.85%, AOF 0.3%의 경우 각각 38.31%±1.36%, 57.10%±0.91%, 61.73%±1.51%로 활성이 나타나는 것을 알 수 있었다(Fig. 1A). 이를 토대로 동백 건과피의 발효 조건을 항산화 활성이 좋은 AOF 0.2%로 정하였다. AOF 0.2%, 30°C 조건으로 시간에 따른 발효에서는 비발효 추출물(unfermented extract)에 비해 항산화 활성이 조금 감소하는 것으로 나타났으나 발효 시간에 따른 발효 추출물 간의 차이는 없었다. 온도에 따른 발효에서는 30°C에서 조금 감소하고 35°C에서는 변화가 없는 것으로 나타났고, 비발효 추출물의 경우 35°C에서의 항산화 활성이 30°C에서의 항산화 활성에 비해 감소하여 나타났다(Fig. 1B, C). 이러한 결과를 통해 발효를 통해 항산화 활성이 감소 또는 증가할 것이라는 예상과 달리 동백 건과피에서 발효는 항산화 활성의 변화에 크게 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있었다.

Fig. 1. DPPH radical scavenging activity of dried CJ pericarp ferment extract. Dried CJ pericarp was fermented by AO at various concentrations (A), time (B), and temperature (C). Except for each condition, fermentation is usually carried out at 30°C and 72 hr. Fermented extract were filtered and lyophilized, and then antioxidant activity was measured. Data are expressed as the mean of triplicate independent experiments±standard deviations. Statistical analyses were performed using paired t-test. CJ, Camellia japonica L.; AO, Aspergillus oryzae; UF, unfermented extract; BHA, butylated hydroxyanisole. *p<0.05, **p<0.01.

총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량

페놀 화합물은 식물들의 2차 대사산물로서 식물계에서 8,000개 이상이 확인되었다[32]. 페놀 화합물은 하나 이상의 하이드록실 그룹을 갖고 있는데[33], 이러한 하이드록실 그룹이 유리기의 수용체로서 free radical들과 쉽게 결합하여 안정화됨으로써 항산화 활성이 나타나는 것으로 알려져 있다[34]. 30°C에서 발효 시간에 따른 총 플라보노이드의 함량은 유의성 있는 변화가 없었지만 총 폴리페놀의 함량은 24시간 발효: 145.1±8.56 mg GAE/g에서 120.7±8.95 mg GAE/g로; 48시간 발효: 127.5±3.89 mg GAE/g에서 98.6±6.62 mg GAE/g로; 72시간 발효: 131.4±1.56 mg GAE/g에서 106.9±1.17 mg GAE/g로 조금 감소하였다. 그리고 발효 72시간 동안 온도에 따른 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량은 변화가 없었다(Table 1).

구강암 세포에 대한 세포독성

AOF의 구강암 세포주에 대한 세포독성을 측정하기 위해 YD-8과 YD-10B 이용하여 MTT 분석을 수행하였다. 그 결과 125, 250, 500 μg/mL의 농도에서는 24시간 후에 세포독성이 나타나지 않았다(Fig. 2A). 48시간 후, YD-8에서 세포 생존력이 250 μg/mL에서 68.37±5.77 (31.3%), 500 μg/mL 48.37±3.13 (51.6%)으로 감소하였고(Fig. 2B), YD-10B에서는 125 μg/mL에서 85.38±4.62 (14.6%), 250 μg/mL에서 77.99±6.15 (22.0%), 500 μg/mL에서 55.59±9.46 (44.4%)으로 유의성있게 감소하였다(Fig. 2C). 상기 농도의 범위에서 정상세포에서도 세포독성을 나타내는지 인간 배아 신장 세포인 293T를 이용하여 확인한 결과 293T에서는 48시간 후 세포독성이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다(Fig. 2D).

Fig. 2. The effects of AOF on the cell viability of oral cancer cells. The extract fermented with AO (0.2%) at 30°C for 72 hr (AOF) was treated with oral cancer cells YD-8 and YD-10B (A, B, and C), and normal cells 293T (D). Cells were treated with various concentration of AOF for 24 hr (A) 48 hr (B, C, and D). Cell viability was measured by MTT assay. Data are expressed as the mean±standard deviations. Statistical analyses were performed using paired t-test. AOF, Aspergillus oryzae fermentation extract; AO, Aspergillus oryzae; UF; unfermented extract. *p<0.05, **p<0.01.

구강암 세포에서 AOF의 세포사멸 유도

구강암 세포에서 AOF에 의한 세포생존력 감소가 세포사멸에 의한 것인지를 확인하기 위하여 western blot 분석을 수행하였다. 구강암세포에 AOF를 125, 250, 500 μg/mL로 처리하고 48시간 후 단백질을 추출하여 절편화된 caspase-3와 PARP 단백질 발현을 확인한 결과 YD-8에서는 125 μg/mL부터 YD-10B에서는 250 μg/mL부터 각 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3A). 이러한 결과를 통해 AOF에 의한 세포생존력 감소는 세포사멸에 의한 것임을 알 수 있었다. 이를 다시 확인하기 위하여 세포가 사멸할 때 세포막의 이중 지질구조 중 phosphatidylserine의 전위가 일어나고, 여기에 annexin V가 특이적으로 결합하는 것을 이용하여 형광을 내는 FITC가 접합된 annexin V와 세포 핵에 결합하는 PI를 이용하여 세포핵의 손상과 함께 정량적 분석을 진행하였다[35]. 그 결과 annexin V, PI, annexin V/PI로 염색된 세포의 합이 YD-8 세포에서는 500 μg/mL에서 약 51% (Fig. 3B), YD-10B 세포에서는 500 μg/mL에서 약 40%가 증가하였다(Fig. 3C). 이러한 연구 결과를 통해 건조된 동백 과피 발효 추출물의 구강암 세포 YD-8과 YD-10B의 세포 생존력 억제 및 세포 사멸을 통해 천연 항암물질로서의 가능성을 제시한다.

Fig. 3. AOF induces apoptosis in oral cancer cells. (A) Cells were treated with various concentration of AOF 0.2% for 48 hr in YD-8 and YD-10B cells. Western blot analysis was used to analyze apoptosis-related factor protein expression. (B, C) Oral cancer cells were treated with indicated concentration of AOF for 48 hr. Apoptotic cells were stained with annexin V and PI and analyzed by Arthur image based cytometry. Data are expressed as mean±standard deviations. The Y-axis represents the percent of cells positive for annexin V (green), PI (red), annexin V and PI (yellow), or negative for annexin V and PI (blue). AOF, Aspergillus oryzae fermentation extract; PI, Propidium Iodide; PARP, poly-ADP ribose polymerase. **p< 0.01, ***p< 0.001 vs. control (comparison of viable cells).

다양한 항암제는 빈혈, 혈소판 감소증, 구토, 설사, 근육 경련 등의 심각한 부작용이 있음이 보고되었으며[36], 기존의 화학요법은 비용이 많이 드는 반면, 식물 유래 성분은 낮은 치료비용과 안전성, 낮은 부작용으로 기존의 치료방법을 개선할 수 있다[13]. 또한, 식물로부터 얻어지는 생물학적 활성 성분은 발효를 통해 항산화, 항암 등 생물학적 활성이 개선이 될 수 있다[37,38]. 발효를 통한 식물 유래 추출물의 변화는 항산화 활성에 대한 상반된 여러 결과를 보여주었다. 매실을 Rhizopus oligosporus와 Aspergillus niger로 고체상태 발효(solid-state fermentation)시킨 경우 항산화 활성이 증가하였고[39], 적포도와 백포도를 Aspergillus carbonarius로 발효시켰을 때 적포도는 항산화 활성이 증가하였지만 백포도는 그 활성이 감소하였다[40]. 이러한 보고들을 통해 발효에 의해 항산화 활성이 개선되는 것만이 아니라는 것을 알 수 있었고, 특히 이번 동백 과피 발효 추출물의 경우 앞에서 보고된 여러 연구와는 다르게 발효에 의한 항산화 활성의 변화가 거의 없음을 알 수 있었다. 발효 추출물의 항암 활성 변화 또한 여러 연구에서 보고되어 왔다. Aspergillus oryzae 발효 현미 추출물의 인간 림프모구백혈병 세포에 대한 항암 활성이 사멸 수용체 및 tBid 매개 경로를 통해 유도됨이 관찰되었고[41], Monascus purpureus 발효 홍누룩미 추출물이 인간 유방 선암종 세포에 대해 강력한 항암 활성을 나타내고[42], 다양한 암 세포주에 대한 동백 과피 Aspergillus oryzae 발효 추출물의 항암 활성 연구가 보고되었다. 두경부 암에 대한 동백 과피의 항암 활성 연구 또한 보고되었는데, 동백 과피 물 추출물의 경우 항암 활성이 없었으나 Aspergillus oryzae 발효를 통해 두경부 암에서 항암 활성이 나타났다. 두경부암, 유방암, 대장암, 자궁경부암에 대한 동백 과피 Aspergillus oryzae 발효 추출물의 효과는 24시간 후 세포 생존능 감소를 나타내었다[43]. 구강암 세포주인 YD-8과 YD-10B에 대한 이번 연구에서는 다른 세포주와 동일하게 세포 생존능의 감소를 나타내었으나 48시간 후에 이러한 효과를 보였다. 이러한 구강암 세포주의 세포 생존능 감소 기전을 알기 위해 western blot과 cytometric assay를 통하여 분석한 결과 파편화된 caspase-3와 PARP의 증가와 annexin V와 PI로 염색된 세포 증가를 통해 세포 사멸에 의한 것임을 알 수 있었다. 이러한 연구 결과는 동백 과피 Aspergillus oryzae 발효 추출물이 구강암 세포의 생존능을 억제함으로써 잠재적인 항암제로서 가능성이 있음을 보여준 것으로 생각된다.

이 논문은 2021년도 광주보건대학교 교내연구비의 지원을 받아 수행된 연구입니다(2021034).

The authors declare that they have no competing interests.